麦蓝菜多糖酸水解特性的初步研究(附件)
本文对麦蓝菜多糖酸水解特性进行初步研究。利用凝胶色谱法测定麦蓝菜多糖水解产物的分子量，分析不同酸水解条件下麦蓝菜多糖水解产物的分子量变化，初步了解麦蓝菜多糖的酸水解特性。结果表明麦蓝菜多糖在pH=1~5条件下水解后发生部分降解，分子量降低，分子量在1×104~3.5×104范围的多糖含量明显增多，且分子量不随时间延长呈趋势性变化；当水解条件为pH=5，时间为20 min，温度为60°C时，降解程度最大。本论文的工作为深入开展麦蓝菜多糖的药用机制研究提供了基础研究资料。关键词 麦蓝菜多糖，酸水解，分子量
目 录
1 引言 1
1.1 麦蓝菜多糖简介 1
1.2 多糖水解研究进展 1
1.3 研究目的与意义 3
2 实验部分 3
2.1 材料、试剂与仪器 3
2.2 实验方法 4
2.3 多糖分子量测定 6
3 结果与分析 6
3.1 碘试液显色法 6
3.2 得率考察 7
3.3 分子量测定 8
总结 15
致谢 16
参考文献 17
1 引言
1.1 麦蓝菜多糖简介
多糖(C6H10O5)n是由十个以上的单糖通过糖苷键聚合而成的，同单糖是由相同的单糖组成的多糖，杂多糖是以不同的单糖组成的多糖。多糖的分子量不明确，只有平均分子量，多糖中单糖数目称为聚合度。多糖不仅具有免疫调节、抗肿瘤的作用，还有抗辐射、降血脂、保护肝等作用[1]。作为提供能量的主要物质之一，它在我们生物体内起着非常大的作用。
本文以麦蓝菜多糖作为研究对象。麦蓝菜（又称王不留行）是石竹科一年生草本植物麦蓝菜干燥成熟的种子。除华南地区以外，该植物在我国大部分地区都有分布，据统计麦蓝菜在河北的产量是所有地区中最大的。作为传统中药的一种，麦蓝菜具有促进泌乳、利尿通淋、抗肿瘤等药理活性。麦蓝菜成分复杂，迄今为止许多化学成分已经被人们从麦蓝菜种子里分离出来，如皂苷类化合物、黄酮类化合物、生物碱类化合物、多糖等。
麦蓝菜多糖属于植物多糖。作为麦蓝菜众多成分的一种，它具有抗氧化活性、利尿通淋、抗肿 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
瘤[23]等作用。李青[4]曾提及到她所在的课题组前期开展关于麦蓝菜化学成分和动物药效的研究，发现麦蓝菜种子中多糖类成分在利尿通淋这一方面具有显著的效果，因此麦蓝菜多糖化学研究的开展很有必要。此外李青[5]等人对麦蓝菜进行水提醇沉，将多糖提取率作为考察指标，运用单因素试验和正交试验，找到提取麦蓝菜多糖的最佳条件。李芸达等人[6]不仅研究影响麦蓝菜多糖提取效果的因素，还分别采用紫外分光光度法和邻苯三酚自氧化法测定其清除自由基能力，评价其体外抗氧化活性。
麦蓝菜多糖具有显著的利尿通淋作用，然而在生物体内，大分子量的天然活性多糖很难被生物吸收并发挥活性，需要在生物体内水解成分子量较小的低聚糖或者寡糖才能更好地被吸收并发挥活性。因此研究麦蓝菜多糖水解行为对于深入了解麦蓝菜多糖的活性发挥有着重要的意义。
1.2 多糖水解研究进展
多糖的成分与结构极其复杂，有数据显示生物体内经过酸水解和酶水解得到的低聚糖在某些方面具有更好的活性。多糖水解过程是糖苷键断裂的过程。分子量减少是衡量麦蓝菜多糖水解成功的重要标志。低分子量的糖得到越多，说明它水解越成功。测量多糖分子量的方法包括黏度法、超离心法、光散射法、渗透压法、体积排阻色谱法及一些联用技术 [79]。目前体积排阻色谱法（凝胶色谱法）较为常用。它只与凝胶颗粒的孔径大小以及需要分离的物质分子大小有关。在洗脱过程中，样品根据组分分子大小的不同进行分离，分子越小，在填料微孔中经过的路径越长，保留时间越长。
常用的多糖水解方法主要包括酸水解、酶水解[10]、碱水解等。
1.2.1 酸水解
酸性水解是一个相对简单，廉价且易于控制的过程，因为反应与培养基的中和作用相互干扰。常用的酸有硫酸、盐酸、磷酸、三氟乙酸(TFA)，其中硫酸难挥发，浓硫酸有强氧化性；盐酸随着浓度的升高易挥发；磷酸难挥发，氧化性弱，但酸性比较弱；三氟乙酸在水解结束后可通过旋转蒸发除去，避免碱中和。实验可通过监测其溶液pH控制酸水解。当pH接近7时，酸水解停止。酸水解与酸浓度、反应时间、温度、底物浓度相关。多糖水解速度随着酸浓度增加、温度升高加快。然而，酸水解可能具有缺点，例如随着有毒物质（糠醛和5羟甲基糠醛）的连续形成、单糖的降解以及低聚糖产率低。另外所得寡糖链的长度也可以发生变化。这些事实表明必须不断监测反应条件（酸浓度，温度和时间）并进行初步测试。一些多糖更容易受酸或温度影响，例如果聚糖。
梁图等人[1112]通过单因素实验研究水解时间、TFA酸浓度和温度因素对黄芪多糖水解程度的影响，比较未水解黄芪多糖的色谱峰变化，找到适宜水解条件。在实验过程中他们发现温度对多糖水解影响非常大，并通过分析酸水解得到大量寡糖片段推断出提取得到的黄芪多糖主要为葡聚糖，被水解为DP4~11的葡寡糖。张燕[13]发现产物分子量随着白及多糖浓度降低而明显降低。在温度与酸度已知的情况下，考察水解时间的影响，发现多糖分子量随酸解时间延长逐渐降低。
还有在酸水解的基础上加入氧化剂。早期楼陈钰[14]在弱酸性条件下，采用过氧化氢法降解壳聚糖。目前高碘酸氧化产物使用比较多，该水解方法称为Smith降解。Smith降解是将高碘酸氧化产物用硼氢化合物还原成稳定的多羟基化合物，然后进行适度的酸水解，用纸层析鉴定水解产物，由水解产物可以推断多糖各组分的连接方式及次序。
1.2.2 酶水解
酶催化水解反应比较温和，专属性高，可以通过酶的特点判断出糖苷键类型，根据水解产物推断它们之间的连接关系。该酶是内切酶还是外切酶很大程度上决定酶水解多糖的程度，内切酶主要作用在糖链中符合其水解条件的糖苷键上，而外切酶则自糖链非还原端开始，沿着糖链逐步降解至糖链分支段。常用的酶有转化糖酶、麦芽糖酶、杏仁苷酶等。酶受温度、时间、pH、底物浓度等因素影响。其中pH和温度是影响酶的重要因素，某些酶的酶解产物会随pH和温度的改变而改变。水解多糖的酶的产生应经过浓缩和分离，以消除微生物污染物。然而酶的分离纯化比较困难和麻烦，为此通过酶水解获得寡糖可能更昂贵。另一个缺点是需要补充剂，这阻碍了最终产品的纯度。此外市场上销售的酶品种有限，反应时不易控制。
吕宁[1516]采用酶水解麦冬多糖，利用凝胶过滤法测定水解产物的相对分子量。通过高效液相法分析酶解产物成分，确定三种组分的单糖组成分别为果糖、果糖、葡萄糖和果糖。研究表明该酶能部分水解麦冬多糖，多糖分子量降低，得到了相对分子质量小于1万的多糖组分。
目 录
1 引言 1
1.1 麦蓝菜多糖简介 1
1.2 多糖水解研究进展 1
1.3 研究目的与意义 3
2 实验部分 3
2.1 材料、试剂与仪器 3
2.2 实验方法 4
2.3 多糖分子量测定 6
3 结果与分析 6
3.1 碘试液显色法 6
3.2 得率考察 7
3.3 分子量测定 8
总结 15
致谢 16
参考文献 17
1 引言
1.1 麦蓝菜多糖简介
多糖(C6H10O5)n是由十个以上的单糖通过糖苷键聚合而成的，同单糖是由相同的单糖组成的多糖，杂多糖是以不同的单糖组成的多糖。多糖的分子量不明确，只有平均分子量，多糖中单糖数目称为聚合度。多糖不仅具有免疫调节、抗肿瘤的作用，还有抗辐射、降血脂、保护肝等作用[1]。作为提供能量的主要物质之一，它在我们生物体内起着非常大的作用。
本文以麦蓝菜多糖作为研究对象。麦蓝菜（又称王不留行）是石竹科一年生草本植物麦蓝菜干燥成熟的种子。除华南地区以外，该植物在我国大部分地区都有分布，据统计麦蓝菜在河北的产量是所有地区中最大的。作为传统中药的一种，麦蓝菜具有促进泌乳、利尿通淋、抗肿瘤等药理活性。麦蓝菜成分复杂，迄今为止许多化学成分已经被人们从麦蓝菜种子里分离出来，如皂苷类化合物、黄酮类化合物、生物碱类化合物、多糖等。
麦蓝菜多糖属于植物多糖。作为麦蓝菜众多成分的一种，它具有抗氧化活性、利尿通淋、抗肿 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
瘤[23]等作用。李青[4]曾提及到她所在的课题组前期开展关于麦蓝菜化学成分和动物药效的研究，发现麦蓝菜种子中多糖类成分在利尿通淋这一方面具有显著的效果，因此麦蓝菜多糖化学研究的开展很有必要。此外李青[5]等人对麦蓝菜进行水提醇沉，将多糖提取率作为考察指标，运用单因素试验和正交试验，找到提取麦蓝菜多糖的最佳条件。李芸达等人[6]不仅研究影响麦蓝菜多糖提取效果的因素，还分别采用紫外分光光度法和邻苯三酚自氧化法测定其清除自由基能力，评价其体外抗氧化活性。
麦蓝菜多糖具有显著的利尿通淋作用，然而在生物体内，大分子量的天然活性多糖很难被生物吸收并发挥活性，需要在生物体内水解成分子量较小的低聚糖或者寡糖才能更好地被吸收并发挥活性。因此研究麦蓝菜多糖水解行为对于深入了解麦蓝菜多糖的活性发挥有着重要的意义。
1.2 多糖水解研究进展
多糖的成分与结构极其复杂，有数据显示生物体内经过酸水解和酶水解得到的低聚糖在某些方面具有更好的活性。多糖水解过程是糖苷键断裂的过程。分子量减少是衡量麦蓝菜多糖水解成功的重要标志。低分子量的糖得到越多，说明它水解越成功。测量多糖分子量的方法包括黏度法、超离心法、光散射法、渗透压法、体积排阻色谱法及一些联用技术 [79]。目前体积排阻色谱法（凝胶色谱法）较为常用。它只与凝胶颗粒的孔径大小以及需要分离的物质分子大小有关。在洗脱过程中，样品根据组分分子大小的不同进行分离，分子越小，在填料微孔中经过的路径越长，保留时间越长。
常用的多糖水解方法主要包括酸水解、酶水解[10]、碱水解等。
1.2.1 酸水解
酸性水解是一个相对简单，廉价且易于控制的过程，因为反应与培养基的中和作用相互干扰。常用的酸有硫酸、盐酸、磷酸、三氟乙酸(TFA)，其中硫酸难挥发，浓硫酸有强氧化性；盐酸随着浓度的升高易挥发；磷酸难挥发，氧化性弱，但酸性比较弱；三氟乙酸在水解结束后可通过旋转蒸发除去，避免碱中和。实验可通过监测其溶液pH控制酸水解。当pH接近7时，酸水解停止。酸水解与酸浓度、反应时间、温度、底物浓度相关。多糖水解速度随着酸浓度增加、温度升高加快。然而，酸水解可能具有缺点，例如随着有毒物质（糠醛和5羟甲基糠醛）的连续形成、单糖的降解以及低聚糖产率低。另外所得寡糖链的长度也可以发生变化。这些事实表明必须不断监测反应条件（酸浓度，温度和时间）并进行初步测试。一些多糖更容易受酸或温度影响，例如果聚糖。
梁图等人[1112]通过单因素实验研究水解时间、TFA酸浓度和温度因素对黄芪多糖水解程度的影响，比较未水解黄芪多糖的色谱峰变化，找到适宜水解条件。在实验过程中他们发现温度对多糖水解影响非常大，并通过分析酸水解得到大量寡糖片段推断出提取得到的黄芪多糖主要为葡聚糖，被水解为DP4~11的葡寡糖。张燕[13]发现产物分子量随着白及多糖浓度降低而明显降低。在温度与酸度已知的情况下，考察水解时间的影响，发现多糖分子量随酸解时间延长逐渐降低。
还有在酸水解的基础上加入氧化剂。早期楼陈钰[14]在弱酸性条件下，采用过氧化氢法降解壳聚糖。目前高碘酸氧化产物使用比较多，该水解方法称为Smith降解。Smith降解是将高碘酸氧化产物用硼氢化合物还原成稳定的多羟基化合物，然后进行适度的酸水解，用纸层析鉴定水解产物，由水解产物可以推断多糖各组分的连接方式及次序。
1.2.2 酶水解
酶催化水解反应比较温和，专属性高，可以通过酶的特点判断出糖苷键类型，根据水解产物推断它们之间的连接关系。该酶是内切酶还是外切酶很大程度上决定酶水解多糖的程度，内切酶主要作用在糖链中符合其水解条件的糖苷键上，而外切酶则自糖链非还原端开始，沿着糖链逐步降解至糖链分支段。常用的酶有转化糖酶、麦芽糖酶、杏仁苷酶等。酶受温度、时间、pH、底物浓度等因素影响。其中pH和温度是影响酶的重要因素，某些酶的酶解产物会随pH和温度的改变而改变。水解多糖的酶的产生应经过浓缩和分离，以消除微生物污染物。然而酶的分离纯化比较困难和麻烦，为此通过酶水解获得寡糖可能更昂贵。另一个缺点是需要补充剂，这阻碍了最终产品的纯度。此外市场上销售的酶品种有限，反应时不易控制。
吕宁[1516]采用酶水解麦冬多糖，利用凝胶过滤法测定水解产物的相对分子量。通过高效液相法分析酶解产物成分，确定三种组分的单糖组成分别为果糖、果糖、葡萄糖和果糖。研究表明该酶能部分水解麦冬多糖，多糖分子量降低，得到了相对分子质量小于1万的多糖组分。
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