莠灭净对植物根系土壤中酚类氧化酶活性的影响
本文研究了在种植不同植物（小麦、黑麦草、玉米、苜蓿）的条件下，当土壤中三嗪类除草剂莠灭净浓度为1mg.kg-1时对土壤中酚类氧化酶（PO）活性的影响。通过室内土培盆栽实验，以无农药处理土壤为空白对照，培养10天后，测定对照组和实验组的根际土、混合土以及非根际土样的酚类氧化酶的活性。实验结果表明种植4种植物时，土壤中酚类氧化酶活力显示的趋势为根际土>混合土>非根际土，可能是植物根际分泌物增多，导致土壤酶的活力增加，且促进了莠灭净的降解。关键字不同植物；莠灭净；土壤；酚类氧化酶；降解Effect of Ametryn on the activity of phenol oxidases in plant roots soilStudent majoring in applied chemistry:Ma LiyaTutorYang HongAbstrat:It was studied that effect of triazine herbicides ametryn at 1mg.kg-1 on the activity of phenol oxidases in soil planted with different plants (Wheat,Ryegrass,Maize,Alfalfa). By indoor plot experiment, pesticide-free treated soil as the blank control, and the activity of phenol oxidases of rhizosphere soil, mixture soil and non- rhizosphere soil of experimental group and control group were detected after planting different plants for 10 days. The results revealed the trend of phenol oxidases activity was followed as: rhizosphere soil> mixture soil> non- rhizosphere soil, it was possible that increase in rhizosph *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
ere secretions resulted in activating soil enzyme activity and promoted the degradation of ametryn.1引言中国是一个农药生产和使用大国[1]，农业生产中为了作物的丰收，不可避免的要使用合适的农药[2],因此农药在人类防治农作物病虫害、草害，粮食的增产增收等诸方面做出了巨大的贡献。而除草剂无疑在农业中发挥了重要作用。但是，因之而来的农药残留问题则对环境和人类健康带来了严重的危害，它对人体有致癌和干扰内分泌的毒性，有些农药比较稳定，容易在土壤中残留，所以探明农药残留对土壤性质影响有十分重要的意义[3,4]。农药进入土壤系统污染土壤的同时，还可通过挥发、扩散、迁移等形式转移到大气、水环境系统及农作物体内，引起环境污染，进而影响农产品质量安全[5]，威胁人类健康。作为5大类常用除草剂之一的三嗪类除草剂，在提高作物产量的同时却也对环境造成了不可忽略的影响。三嗪类除草剂具有性质稳定、持效期长的特点，易贮存在土壤中，对植物体的正常生长、人类的健康带来威胁，三嗪类除草剂不仅具有致畸、致癌、致突变的“三致”作用，而且还能干扰内分泌系统，影响内分泌系统的正常功能，世界上多个国家已经将三嗪类除草剂阿特拉津列入内分泌干扰剂化合物的名单[6]。莠灭净作为三嗪类除草剂阿特拉津的深度加工产品，其对土壤的污染也同样引起了广泛关注。而农药进入土壤会以农药本身或其分解产物的形式残留在土壤环境中，从而对土壤生态环境以及酶活性产生影响。农药可以直接抑制或激活土壤酶活性，也能够通过改变土壤生物组成、植物根系功能等间接影响土壤酶活性。同时土壤酚类氧化酶（PO）通常对外源污染物较敏感，参与降解许多顽固的芳香族类化合物。土壤酚类氧化酶能把土壤中芳香族化合物氧化成醌,醌与土壤中蛋白质、氨基酸、糖类、矿物等物质反应生成大小分子量不等有机质和色素,完成土壤芳香族化合物循环[7-9]。PO这种氧化酶具有不同水解酶的催化机制，特别是质子和电子迁移在这种酶反应中的偶联作用 [10]认为根际土壤的微生物群落可以促进难降解污染物的降解如多环芳香烃（PAHs）。本文研究的对象主要为三嗪类除草剂中的莠灭净，化学名称N-2-乙氨基-N-4-异丙氨基-6-甲硫基-1,3,5-三嗪;2-甲硫基-4-乙氨基-6-异丙氨基-1,3,5-三嗪，是一种高效三嗪类除草剂，化学结构式如图1所示: 图1莠灭净化学结构式本文通过小麦、黑麦草、玉米和苜蓿4种植物种植于莠灭净污染土壤（1.0 mg kg-1）中生长10 d为处理组，种植于无污染物土壤10 d，莠灭净污染土壤以及无污染土壤培养10天为空白对照组。在第10天，测定根际土、混合土以及非根际土的酚类氧化酶的活性，来探明莠灭净在种植不同植物下对土壤中酚类氧化酶的影响。2材料与方法 2.1实验仪器GX-300D 型培养箱（宁波江南仪器厂）；BS224S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司) ；KH-500超声波清洗器 (昆山禾创超声仪器有限公司)；CR20B2 高速冷冻离心机离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；1800紫外-分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；高效液相色谱仪(美国，waters)，配2487双波长紫外检测器，515定量输液泵，77251定量进样阀；WD-35旋转浓缩仪(瑞士，BuCHI)；DLSB-低温冷却循环泵(郑州长城科工贸有限公司)；SHB-B95型循环水时多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；BS224S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。 2.2实验材料与试剂样品土样采集于江苏省南京市玄武区下马坊，土样类型为粘磐土，土样经过粗磨后过3mm筛后待用。莠灭净（97%）、小麦（正麦7号）和玉米（苏科花糯2008）均由中国江苏省农业科学院提供。黑麦草（长江2号）和苜蓿（陇东）由成都大业集团提供。莠灭净原药，纯度97%，由中国江苏省农业科学院提供。过氧化氢（H2O2）、蒸馏水、2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐（ABTS）、顺丁烯二酸、柠檬酸、硼酸、氢氧化钠、盐酸均为分析纯。2.3酚类氧化酶测定2.3.1种子的萌发及盆栽实验植物种子（小麦、黑麦草、玉米、苜蓿）于3% 的H2O2溶液进行消毒15min，用去离子水多次清洗，放置培养皿中，加蒸馏水至浸没种子一半，20℃下暗培2-3天发芽待用。配制污染土壤浓度为1mg.kg-1，分别种植处理过的种子（小麦、黑麦草、玉米、苜蓿），与未种植物的受农药污染的土壤以及未受农药污染的土壤均加水至土壤最大持水量的13%，在以25℃的光照条件14 h, 20℃的暗条件10 h为周期培养10天，取相关土样加以检测。2.3.2 缓冲液MUB的制备0.605 g Tris，0.58g 顺丁烯二酸，0.7 g 柠檬酸，0.015 g 硼酸加入到25 mL 1mol/L的NaOH中，定容至50 mL。取50mL MUB母液用0.1M NaOH/HCl调制pH=2，定容至250 mL。2.3.3土壤的灭菌称取(0.100±0.001 g)的加药土样和空白土样的根际土、混合土和非根际土于10 mL的离心管，用高压蒸汽法在120℃灭菌1 h，冷却待用。2.3.4反应混合液的配制称取(0.100±0.001g)的加药土样和空白土样的根际土、混合土和非根际土于10 mL的离心管中，加入5 mL的MUB缓冲溶液，加入200 μL 0.01M ABTs溶液，30℃培养5 min，取出后4℃，12000 g离心6 min，取上清液待测。2.3.5空白对照的设定采用灭菌土样于反应混合液中反应待测；在反应混合液中不加ABTs待测；在反应混合液中不加土壤待测。2.3.6仪器测定条件将提取的上清液用紫外-可见分光光度计于420 nm条件下检测。2.4土壤中莠灭净的残留量检测2.4.1土壤前处理称取 10 g 土样放在 50 mL 离心管中，加入 25 mL (丙酮水=3:1，v:v)提取液，超声提取 30 min，4000 g 离心 5 min，上清液过滤到125 mL平底烧瓶中，上述提取过程重复操作3次。合并的滤液置于 40℃真空旋转浓缩仪除去丙酮，剩余的水相转移入分液漏斗。用石油醚萃取水相3次，每次15 mL。收集合并有机相，用无水硫酸钠除去少量水份。有机相40℃ 真空旋转浓缩至干。样品用 2 mL 色谱甲醇定容，待HPLC检测。2.4.2高效液相色谱定量分析方法色谱柱C8柱 (250 × 4. 6 mm i. d., 5 μm)；柱温室温；流动相甲醇:水=75:25 (V/V)，流速0.6 mL min-1；紫外检测波长254 nm；进样量20 μL；外标法定量。3结果与分析3.1莠灭净对种植小麦的土壤酚类氧化酶的影响 图2 莠灭净对种植小麦的土壤PO酶的影响（不同字母表示有显著性差异（P<0.05）；RS-根际土，BS-混合土，NRS-非根际土）从图2莠灭净在种植小麦下对土壤中酚类氧化酶的影响曲线可以看出，加药土壤和无污染土壤存在明显的差异，根际土、混合土和非根际土均存在明显的差异。土壤酚类氧化酶的活性均是根际土>混合土>非根际土，同时加药土壤的酚类氧化酶活性均比不加药土壤的的酚类氧化酶活性低。推断在种植小麦的情况下，植物根系激活了土壤中酚类氧化酶的活性，而莠灭净抑制了土壤中酚类氧化酶的活性。3.2莠灭净对种植黑麦草的土壤酚类氧化酶的影响图3莠灭净对种植黑麦草的土壤PO酶的影响（不同字母表示有显著性差异（P<0.05）；RS-根际土，BS-混合土，NRS-非根际土）从图3莠灭净在种植黑麦草下对土壤中酚类氧化酶的影响曲线可以看出，加药土壤和不加药土壤之间存在明显的差异，根际土、混合土以及非根际土之间也存在明显的差异。土样中酚类氧化酶活性均是根际土>混合土>非根际土，在种植黑麦草的情况下，加药土壤中酚类氧化酶活性均比不加药的土壤中的酚类氧化酶的活性要高。推断在种植黑麦草的情况下，植物根系激活了土壤中酚类氧化酶的活性，而莠灭净激活了土壤中酚类氧化酶的活性。3.3莠灭净对种植玉米的土壤酚类氧化酶的影响图4莠灭净对种植玉米的土壤PO酶的影响（不同字母表示有显著性差异（P<0.05）；RS-根际土，BS-混合土，NRS-非根际土）从图4莠灭净在种植玉米下对土壤中酚类氧化酶的影响曲线可以看出，不加药土壤的根际土、混合土和非根际土没有明显的差异，加药土壤的根际土和混合土没有明显的差异，与非根际土有明显的差异，但是加药土壤和不加药土壤之间酚类氧化酶的活性有明显的差异，该种可能是因为玉米根系过于发达，在处理根际土、混合土和非根际土的时较难区分。土样中酚类氧化酶的活性为根际土>混合土>分根际土，在种植玉米的情况下，加药土壤中酚类氧化酶的活性大于不加药土壤中酚类氧化酶的活性。推断在种植玉米的情况下，植物根系激活了土壤中酚类氧化酶的活性，而莠灭净抑制了土壤中酚类氧化酶的活性。3.4莠灭净对种植苜蓿的土壤酚类氧化酶的影响图5莠灭净对种植苜蓿的土壤PO酶的影响（不同字母表示有显著性差异（P<0.05）；RS-根际土，BS-混合土，NRS-非根际土）从图5莠灭净在种植苜蓿下对土壤中酚类氧化酶的影响曲线可以看出，加药土壤和不加药土壤的根际土、混合土和非根际土存在明显的差异，同时加药土壤和不加药土壤也存在明显的差异。土样中酚类氧化酶的活性为根际土>混合土>非根际土，同时在种植苜蓿的情况下加药土壤酚类氧化酶活性比不加药土壤酚类氧化酶活性低。推断在种植苜蓿的情况下，植物根系会激活了土壤中酚类氧化酶的活性，而莠灭净抑制了土壤中酚类氧化酶的活性。3.5莠灭净对种植不同植物的土壤酚类氧化酶的影响图6莠灭净对种植不同植物的土壤PO酶的影响（不同字母表示有显著性差异（P<0.05）；RS-根际土，BS-混合土，NRS-非根际土）从图6莠灭净在种植四种不同植物下对土壤中酚类氧化酶活性的影响柱状图中可以看出，在种植小麦、玉米、苜蓿时，在加药土壤中，根际土、混合土和非根际土样的种类氧化酶活性均比不加药处理土壤中酚类氧化酶活性低，这说明了在种植小麦、玉米、苜蓿时，莠灭净抑制了土壤中酚类氧化酶的活性；而在种植了黑麦草时，则呈现了相反的现象，表明在种植黑麦草时，莠灭净激活了土壤中酚类氧化酶的活性。图型中同样可以看出加药土壤和不加药土壤中的根际土、混合土和非根际土的酚类氧化酶的活性均存在明显的差异，土壤中酚类氧化酶的活性均是根际土>混合土>非根际土，则说明了植物根系激活了土壤中酚类氧化酶的活性。3.6莠灭净在土壤中的残留量图7不同处理土壤中莠灭净的残留分布（不同字母表示有显著性差异（P<0.05）；RS-根际土，BS-混合土，NRS-非根际土）从不同处理土壤莠灭净残留分布图可以看出，莠灭净残留量是空白>非根际土>混合土>根际土，这种情况说明了小麦、黑麦草、玉米、苜蓿对土壤中莠灭净的降解均有一定的促进作用。在非根际土壤中，种植四种植物间和空白对照组之间没有明显的差异；混合土壤中，莠灭净降解率最高的是黑麦草，其次为小麦和苜蓿，最低的是玉米；根际土壤中，在种植黑麦草和苜蓿时，莠灭净降解率最高，两者没有明显的差异，而在种植玉米时降解率最低。而种植不同的植物，农药莠灭净降解率不同，可能是植物粉剂分泌物不同，使得根际微生物环境不同，导致农药莠灭净降价率不同。4讨论本实验在研究莠灭净在种植不同植物(小麦、黑麦草、玉米、苜蓿)的条件下对土壤中酚类氧化酶活性影响的过程中，主要是利用底物ABTs在酚类氧化酶的作用下生成ABTs自由基，而ABTs自由基在420nm处响应值远大于ABTs，从检测结果我们发现，根际土、混合土以及非根际土中酚类氧化酶活性依次降低，推断植物根系激活了土壤中酚类氧化酶的活性。对于种植不同植物，莠灭净处理土壤和无处理土壤中酚类氧化酶呈现出不同的趋势变化。相对于空白处理土壤，莠灭净处理的土壤中的酚类氧化酶在种植小麦、玉米、苜蓿的情况下活性降低；在种植黑麦草的情况下活性增强。污染土壤上种植植物后，PO酶活力不是呈现单一的变化趋势，这可能是由于莠灭净与种植植物、植物品种等变化因素共同决定的。有一点可确定种植植物可以提高土壤微生物的活力，从而加速土壤中莠灭净的降解。在加药土壤中种植四种不同的植物（小麦、黑麦草、玉米、苜蓿），在种植黑麦草时，土壤中莠灭净的残留量最少，猜测黑麦草的某种根际分泌物激活了酚类氧化酶的活性，从而促进了土壤中莠灭净的降解。在种植植物的情况下，莠灭净的降解主要通过在植物体内富集以及直接降解。在加药土壤中种植植物，相比较在无农药处理下，仅有种植黑麦草的根际土、混合土以及非根际土的酚类氧化酶活性是被激活的，推测土壤中莠灭净浓度降低主要通过直接降解。植物根际可以分泌糖、有机酸、氨基酸等，通过种植植物的方法提供特定的共生微生物（如菌根，根瘤菌）微环境或微生物群落促进污染物的降解[11]研究显示植物根际的微生物活性不仅可以促进农药的降解还对于持久性的工业化学品如多环芳烃的降解也有促进作用。这也说明根际分泌物改变了微生物生长环境，促进了微生物的生长，从而加速了莠灭净在土壤中的降解。5不足与展望不足之处本实验采用的是将实验组和对照组进行培养10天后加以检测，但是可能酶的活性是连续的过程，可能出现先上升后下降的趋势、先下降后上升、上升再趋于稳定、下降再趋于稳定等各种趋势，单从一个时间点无法判别土壤中酚类氧化酶活性变化趋势。实验土样采用的是湿土，称取的质量为(0.100±0.001g)，取量较少，选取的土样保证平行较难，主要采用多取平行样来减少误差。本文检测的是酚类氧化酶的活性，酶的活性与pH、温度等均会影响其测定结果[12]，实验中对pH主要是通过MUB缓冲液控制，对温度主要是通过低温高速离心时利用低温来降低酶的活性，减缓底物与酶的反应。在检测的同时，温度升高，酶的活性也增强，检测时间长短也可能会影响检测结果。展望实验采用的底物是ABTs，还可以采用愈创木酚、左旋多巴等，实验过程在测定酚类氧化酶活性的时候可以用愈创木酚、左旋多巴法加以检测，与ABTs法加以对比，利用三个方法加以检测，分析优劣。本文是莠灭净对植物根际土壤中酚类氧化酶活性研究，实验结果表明种植不同的植物（小麦、黑麦草、苜蓿、玉米）均对莠灭净有一定的降解作用。这一实验成果也希望对土壤中农药的降解研究有帮助，改善土壤中三嗪类农药的残留问题。致谢参考文献[1]赖惠春,王富华,邓义才,等．国内外农药残留分析技术研究现状与发展[J]．广东农业科学，2006, 176-77．[2]高鹤鹃．食品中的有害物质[M].北京北京工业出版社，2000．[3]竹才众．环境持久性毒物研究进展概述[J]．疾病控制杂志，2005，9(4)331-335[4]安琼，董元华,王辉,等.苏南农田土壤有机氯农药残留规律[J].土壤学报,2004, 41(3): 414-419.[5]孔晓华. 化学农药与土壤污染[J]. 现代农业, 2010, 3: 29.[6]王海涛, 张睿, 李育左, 等. 高效液相色谱-串联质谱法检测粮谷中三嗪类除草剂残留量[J]. 分析试验室, 2009, 28(B05): 236-239.[7]贾新民,于泉林,沙永平,等.大豆连作土壤多酚氧化酶研究[J].黑龙江八一农垦大学学报,1995, 8(2):40-43.[8]Toscano G, Colarieti ML, Greco G. Oxidative polymerization of phenols by a phenol oxidase from green olive[J]. Enzyme and Microbial Technology,2003,33: 47-54.[9]Trasar-Cepeda C, Leiro’s MC, Seoane S, Gil-Sotres D. Limitations of soil enzymes as indicators of soil pollution[J]. Soil Biology & Biochemistry, 2000, 32:1869-1875.[10] Johnson DL, Maguire KL, Anderson DR, McGrath SP. Enhanced dissipation of chrysene in planted soil: the impact of a rhizobial inoculum[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2004, 36(1): 33-38.[11] Siciliano SD, Germida JJ. Biolog analysis and fatty acid methyl ester profiles indicate that pseudomonad inoculants that promote phytoremediation alter the root-associated microbial community of Bromus biebersteinii[J]. Soil Biology and Biochemistry, 1998, 30(13): 1717-1723.[12]郝建朝，吴沿友，连宾，等.土壤多酚氧化酶性质研究及意义[J]. 2006, 37(3):470-474.
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key Words 1
1引言 1
2 材料与方法 2
2.1 实验仪器 2
2.2 实验材料与试剂 2
2.3 酚类氧化酶测定 3
2.3.1种子的萌发及盆栽实验 3
2.3.2 缓冲液MUB的制备 3
2.3.3 土壤的灭菌 3
2.3.4反应混合液的配制 3
2.3.5 空白对照的设定 3
2.3.6 仪器检测条件 3
2.4 土壤中莠灭净的残留量检测 3
2.4.1土壤前处理 3
2.4.2 高效液相色谱定量分析方法 4
3 结果与分析 4
3.1莠灭净对种植小麦的土壤酚类氧化酶的影响 4
3.2莠灭净对种植黑麦草的土壤酚类氧化酶的影响 5
3.3莠灭净对种植玉米的土壤酚类氧化酶的影响 5
3.4莠灭净对种植苜蓿的土壤酚类氧化酶的影响 6
3.5莠灭净对种植不同植物的土壤酚类氧化酶的影响 6
3.6 莠灭净在土壤中的残留量 7
4 讨论 8
5 不足与展望 8
致谢 9
参考文献 9
莠灭净对植物根系土壤中酚类氧化酶活性的影响
引言
ere secretions resulted in activating soil enzyme activity and promoted the degradation of ametryn.1引言中国是一个农药生产和使用大国[1]，农业生产中为了作物的丰收，不可避免的要使用合适的农药[2],因此农药在人类防治农作物病虫害、草害，粮食的增产增收等诸方面做出了巨大的贡献。而除草剂无疑在农业中发挥了重要作用。但是，因之而来的农药残留问题则对环境和人类健康带来了严重的危害，它对人体有致癌和干扰内分泌的毒性，有些农药比较稳定，容易在土壤中残留，所以探明农药残留对土壤性质影响有十分重要的意义[3,4]。农药进入土壤系统污染土壤的同时，还可通过挥发、扩散、迁移等形式转移到大气、水环境系统及农作物体内，引起环境污染，进而影响农产品质量安全[5]，威胁人类健康。作为5大类常用除草剂之一的三嗪类除草剂，在提高作物产量的同时却也对环境造成了不可忽略的影响。三嗪类除草剂具有性质稳定、持效期长的特点，易贮存在土壤中，对植物体的正常生长、人类的健康带来威胁，三嗪类除草剂不仅具有致畸、致癌、致突变的“三致”作用，而且还能干扰内分泌系统，影响内分泌系统的正常功能，世界上多个国家已经将三嗪类除草剂阿特拉津列入内分泌干扰剂化合物的名单[6]。莠灭净作为三嗪类除草剂阿特拉津的深度加工产品，其对土壤的污染也同样引起了广泛关注。而农药进入土壤会以农药本身或其分解产物的形式残留在土壤环境中，从而对土壤生态环境以及酶活性产生影响。农药可以直接抑制或激活土壤酶活性，也能够通过改变土壤生物组成、植物根系功能等间接影响土壤酶活性。同时土壤酚类氧化酶（PO）通常对外源污染物较敏感，参与降解许多顽固的芳香族类化合物。土壤酚类氧化酶能把土壤中芳香族化合物氧化成醌,醌与土壤中蛋白质、氨基酸、糖类、矿物等物质反应生成大小分子量不等有机质和色素,完成土壤芳香族化合物循环[7-9]。PO这种氧化酶具有不同水解酶的催化机制，特别是质子和电子迁移在这种酶反应中的偶联作用 [10]认为根际土壤的微生物群落可以促进难降解污染物的降解如多环芳香烃（PAHs）。本文研究的对象主要为三嗪类除草剂中的莠灭净，化学名称N-2-乙氨基-N-4-异丙氨基-6-甲硫基-1,3,5-三嗪;2-甲硫基-4-乙氨基-6-异丙氨基-1,3,5-三嗪，是一种高效三嗪类除草剂，化学结构式如图1所示: 图1莠灭净化学结构式本文通过小麦、黑麦草、玉米和苜蓿4种植物种植于莠灭净污染土壤（1.0 mg kg-1）中生长10 d为处理组，种植于无污染物土壤10 d，莠灭净污染土壤以及无污染土壤培养10天为空白对照组。在第10天，测定根际土、混合土以及非根际土的酚类氧化酶的活性，来探明莠灭净在种植不同植物下对土壤中酚类氧化酶的影响。2材料与方法 2.1实验仪器GX-300D 型培养箱（宁波江南仪器厂）；BS224S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司) ；KH-500超声波清洗器 (昆山禾创超声仪器有限公司)；CR20B2 高速冷冻离心机离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；1800紫外-分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；高效液相色谱仪(美国，waters)，配2487双波长紫外检测器，515定量输液泵，77251定量进样阀；WD-35旋转浓缩仪(瑞士，BuCHI)；DLSB-低温冷却循环泵(郑州长城科工贸有限公司)；SHB-B95型循环水时多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；BS224S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。 2.2实验材料与试剂样品土样采集于江苏省南京市玄武区下马坊，土样类型为粘磐土，土样经过粗磨后过3mm筛后待用。莠灭净（97%）、小麦（正麦7号）和玉米（苏科花糯2008）均由中国江苏省农业科学院提供。黑麦草（长江2号）和苜蓿（陇东）由成都大业集团提供。莠灭净原药，纯度97%，由中国江苏省农业科学院提供。过氧化氢（H2O2）、蒸馏水、2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐（ABTS）、顺丁烯二酸、柠檬酸、硼酸、氢氧化钠、盐酸均为分析纯。2.3酚类氧化酶测定2.3.1种子的萌发及盆栽实验植物种子（小麦、黑麦草、玉米、苜蓿）于3% 的H2O2溶液进行消毒15min，用去离子水多次清洗，放置培养皿中，加蒸馏水至浸没种子一半，20℃下暗培2-3天发芽待用。配制污染土壤浓度为1mg.kg-1，分别种植处理过的种子（小麦、黑麦草、玉米、苜蓿），与未种植物的受农药污染的土壤以及未受农药污染的土壤均加水至土壤最大持水量的13%，在以25℃的光照条件14 h, 20℃的暗条件10 h为周期培养10天，取相关土样加以检测。2.3.2 缓冲液MUB的制备0.605 g Tris，0.58g 顺丁烯二酸，0.7 g 柠檬酸，0.015 g 硼酸加入到25 mL 1mol/L的NaOH中，定容至50 mL。取50mL MUB母液用0.1M NaOH/HCl调制pH=2，定容至250 mL。2.3.3土壤的灭菌称取(0.100±0.001 g)的加药土样和空白土样的根际土、混合土和非根际土于10 mL的离心管，用高压蒸汽法在120℃灭菌1 h，冷却待用。2.3.4反应混合液的配制称取(0.100±0.001g)的加药土样和空白土样的根际土、混合土和非根际土于10 mL的离心管中，加入5 mL的MUB缓冲溶液，加入200 μL 0.01M ABTs溶液，30℃培养5 min，取出后4℃，12000 g离心6 min，取上清液待测。2.3.5空白对照的设定采用灭菌土样于反应混合液中反应待测；在反应混合液中不加ABTs待测；在反应混合液中不加土壤待测。2.3.6仪器测定条件将提取的上清液用紫外-可见分光光度计于420 nm条件下检测。2.4土壤中莠灭净的残留量检测2.4.1土壤前处理称取 10 g 土样放在 50 mL 离心管中，加入 25 mL (丙酮水=3:1，v:v)提取液，超声提取 30 min，4000 g 离心 5 min，上清液过滤到125 mL平底烧瓶中，上述提取过程重复操作3次。合并的滤液置于 40℃真空旋转浓缩仪除去丙酮，剩余的水相转移入分液漏斗。用石油醚萃取水相3次，每次15 mL。收集合并有机相，用无水硫酸钠除去少量水份。有机相40℃ 真空旋转浓缩至干。样品用 2 mL 色谱甲醇定容，待HPLC检测。2.4.2高效液相色谱定量分析方法色谱柱C8柱 (250 × 4. 6 mm i. d., 5 μm)；柱温室温；流动相甲醇:水=75:25 (V/V)，流速0.6 mL min-1；紫外检测波长254 nm；进样量20 μL；外标法定量。3结果与分析3.1莠灭净对种植小麦的土壤酚类氧化酶的影响 图2 莠灭净对种植小麦的土壤PO酶的影响（不同字母表示有显著性差异（P<0.05）；RS-根际土，BS-混合土，NRS-非根际土）从图2莠灭净在种植小麦下对土壤中酚类氧化酶的影响曲线可以看出，加药土壤和无污染土壤存在明显的差异，根际土、混合土和非根际土均存在明显的差异。土壤酚类氧化酶的活性均是根际土>混合土>非根际土，同时加药土壤的酚类氧化酶活性均比不加药土壤的的酚类氧化酶活性低。推断在种植小麦的情况下，植物根系激活了土壤中酚类氧化酶的活性，而莠灭净抑制了土壤中酚类氧化酶的活性。3.2莠灭净对种植黑麦草的土壤酚类氧化酶的影响图3莠灭净对种植黑麦草的土壤PO酶的影响（不同字母表示有显著性差异（P<0.05）；RS-根际土，BS-混合土，NRS-非根际土）从图3莠灭净在种植黑麦草下对土壤中酚类氧化酶的影响曲线可以看出，加药土壤和不加药土壤之间存在明显的差异，根际土、混合土以及非根际土之间也存在明显的差异。土样中酚类氧化酶活性均是根际土>混合土>非根际土，在种植黑麦草的情况下，加药土壤中酚类氧化酶活性均比不加药的土壤中的酚类氧化酶的活性要高。推断在种植黑麦草的情况下，植物根系激活了土壤中酚类氧化酶的活性，而莠灭净激活了土壤中酚类氧化酶的活性。3.3莠灭净对种植玉米的土壤酚类氧化酶的影响图4莠灭净对种植玉米的土壤PO酶的影响（不同字母表示有显著性差异（P<0.05）；RS-根际土，BS-混合土，NRS-非根际土）从图4莠灭净在种植玉米下对土壤中酚类氧化酶的影响曲线可以看出，不加药土壤的根际土、混合土和非根际土没有明显的差异，加药土壤的根际土和混合土没有明显的差异，与非根际土有明显的差异，但是加药土壤和不加药土壤之间酚类氧化酶的活性有明显的差异，该种可能是因为玉米根系过于发达，在处理根际土、混合土和非根际土的时较难区分。土样中酚类氧化酶的活性为根际土>混合土>分根际土，在种植玉米的情况下，加药土壤中酚类氧化酶的活性大于不加药土壤中酚类氧化酶的活性。推断在种植玉米的情况下，植物根系激活了土壤中酚类氧化酶的活性，而莠灭净抑制了土壤中酚类氧化酶的活性。3.4莠灭净对种植苜蓿的土壤酚类氧化酶的影响图5莠灭净对种植苜蓿的土壤PO酶的影响（不同字母表示有显著性差异（P<0.05）；RS-根际土，BS-混合土，NRS-非根际土）从图5莠灭净在种植苜蓿下对土壤中酚类氧化酶的影响曲线可以看出，加药土壤和不加药土壤的根际土、混合土和非根际土存在明显的差异，同时加药土壤和不加药土壤也存在明显的差异。土样中酚类氧化酶的活性为根际土>混合土>非根际土，同时在种植苜蓿的情况下加药土壤酚类氧化酶活性比不加药土壤酚类氧化酶活性低。推断在种植苜蓿的情况下，植物根系会激活了土壤中酚类氧化酶的活性，而莠灭净抑制了土壤中酚类氧化酶的活性。3.5莠灭净对种植不同植物的土壤酚类氧化酶的影响图6莠灭净对种植不同植物的土壤PO酶的影响（不同字母表示有显著性差异（P<0.05）；RS-根际土，BS-混合土，NRS-非根际土）从图6莠灭净在种植四种不同植物下对土壤中酚类氧化酶活性的影响柱状图中可以看出，在种植小麦、玉米、苜蓿时，在加药土壤中，根际土、混合土和非根际土样的种类氧化酶活性均比不加药处理土壤中酚类氧化酶活性低，这说明了在种植小麦、玉米、苜蓿时，莠灭净抑制了土壤中酚类氧化酶的活性；而在种植了黑麦草时，则呈现了相反的现象，表明在种植黑麦草时，莠灭净激活了土壤中酚类氧化酶的活性。图型中同样可以看出加药土壤和不加药土壤中的根际土、混合土和非根际土的酚类氧化酶的活性均存在明显的差异，土壤中酚类氧化酶的活性均是根际土>混合土>非根际土，则说明了植物根系激活了土壤中酚类氧化酶的活性。3.6莠灭净在土壤中的残留量图7不同处理土壤中莠灭净的残留分布（不同字母表示有显著性差异（P<0.05）；RS-根际土，BS-混合土，NRS-非根际土）从不同处理土壤莠灭净残留分布图可以看出，莠灭净残留量是空白>非根际土>混合土>根际土，这种情况说明了小麦、黑麦草、玉米、苜蓿对土壤中莠灭净的降解均有一定的促进作用。在非根际土壤中，种植四种植物间和空白对照组之间没有明显的差异；混合土壤中，莠灭净降解率最高的是黑麦草，其次为小麦和苜蓿，最低的是玉米；根际土壤中，在种植黑麦草和苜蓿时，莠灭净降解率最高，两者没有明显的差异，而在种植玉米时降解率最低。而种植不同的植物，农药莠灭净降解率不同，可能是植物粉剂分泌物不同，使得根际微生物环境不同，导致农药莠灭净降价率不同。4讨论本实验在研究莠灭净在种植不同植物(小麦、黑麦草、玉米、苜蓿)的条件下对土壤中酚类氧化酶活性影响的过程中，主要是利用底物ABTs在酚类氧化酶的作用下生成ABTs自由基，而ABTs自由基在420nm处响应值远大于ABTs，从检测结果我们发现，根际土、混合土以及非根际土中酚类氧化酶活性依次降低，推断植物根系激活了土壤中酚类氧化酶的活性。对于种植不同植物，莠灭净处理土壤和无处理土壤中酚类氧化酶呈现出不同的趋势变化。相对于空白处理土壤，莠灭净处理的土壤中的酚类氧化酶在种植小麦、玉米、苜蓿的情况下活性降低；在种植黑麦草的情况下活性增强。污染土壤上种植植物后，PO酶活力不是呈现单一的变化趋势，这可能是由于莠灭净与种植植物、植物品种等变化因素共同决定的。有一点可确定种植植物可以提高土壤微生物的活力，从而加速土壤中莠灭净的降解。在加药土壤中种植四种不同的植物（小麦、黑麦草、玉米、苜蓿），在种植黑麦草时，土壤中莠灭净的残留量最少，猜测黑麦草的某种根际分泌物激活了酚类氧化酶的活性，从而促进了土壤中莠灭净的降解。在种植植物的情况下，莠灭净的降解主要通过在植物体内富集以及直接降解。在加药土壤中种植植物，相比较在无农药处理下，仅有种植黑麦草的根际土、混合土以及非根际土的酚类氧化酶活性是被激活的，推测土壤中莠灭净浓度降低主要通过直接降解。植物根际可以分泌糖、有机酸、氨基酸等，通过种植植物的方法提供特定的共生微生物（如菌根，根瘤菌）微环境或微生物群落促进污染物的降解[11]研究显示植物根际的微生物活性不仅可以促进农药的降解还对于持久性的工业化学品如多环芳烃的降解也有促进作用。这也说明根际分泌物改变了微生物生长环境，促进了微生物的生长，从而加速了莠灭净在土壤中的降解。5不足与展望不足之处本实验采用的是将实验组和对照组进行培养10天后加以检测，但是可能酶的活性是连续的过程，可能出现先上升后下降的趋势、先下降后上升、上升再趋于稳定、下降再趋于稳定等各种趋势，单从一个时间点无法判别土壤中酚类氧化酶活性变化趋势。实验土样采用的是湿土，称取的质量为(0.100±0.001g)，取量较少，选取的土样保证平行较难，主要采用多取平行样来减少误差。本文检测的是酚类氧化酶的活性，酶的活性与pH、温度等均会影响其测定结果[12]，实验中对pH主要是通过MUB缓冲液控制，对温度主要是通过低温高速离心时利用低温来降低酶的活性，减缓底物与酶的反应。在检测的同时，温度升高，酶的活性也增强，检测时间长短也可能会影响检测结果。展望实验采用的底物是ABTs，还可以采用愈创木酚、左旋多巴等，实验过程在测定酚类氧化酶活性的时候可以用愈创木酚、左旋多巴法加以检测，与ABTs法加以对比，利用三个方法加以检测，分析优劣。本文是莠灭净对植物根际土壤中酚类氧化酶活性研究，实验结果表明种植不同的植物（小麦、黑麦草、苜蓿、玉米）均对莠灭净有一定的降解作用。这一实验成果也希望对土壤中农药的降解研究有帮助，改善土壤中三嗪类农药的残留问题。致谢参考文献[1]赖惠春,王富华,邓义才,等．国内外农药残留分析技术研究现状与发展[J]．广东农业科学，2006, 176-77．[2]高鹤鹃．食品中的有害物质[M].北京北京工业出版社，2000．[3]竹才众．环境持久性毒物研究进展概述[J]．疾病控制杂志，2005，9(4)331-335[4]安琼，董元华,王辉,等.苏南农田土壤有机氯农药残留规律[J].土壤学报,2004, 41(3): 414-419.[5]孔晓华. 化学农药与土壤污染[J]. 现代农业, 2010, 3: 29.[6]王海涛, 张睿, 李育左, 等. 高效液相色谱-串联质谱法检测粮谷中三嗪类除草剂残留量[J]. 分析试验室, 2009, 28(B05): 236-239.[7]贾新民,于泉林,沙永平,等.大豆连作土壤多酚氧化酶研究[J].黑龙江八一农垦大学学报,1995, 8(2):40-43.[8]Toscano G, Colarieti ML, Greco G. 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目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key Words 1
1引言 1
2 材料与方法 2
2.1 实验仪器 2
2.2 实验材料与试剂 2
2.3 酚类氧化酶测定 3
2.3.1种子的萌发及盆栽实验 3
2.3.2 缓冲液MUB的制备 3
2.3.3 土壤的灭菌 3
2.3.4反应混合液的配制 3
2.3.5 空白对照的设定 3
2.3.6 仪器检测条件 3
2.4 土壤中莠灭净的残留量检测 3
2.4.1土壤前处理 3
2.4.2 高效液相色谱定量分析方法 4
3 结果与分析 4
3.1莠灭净对种植小麦的土壤酚类氧化酶的影响 4
3.2莠灭净对种植黑麦草的土壤酚类氧化酶的影响 5
3.3莠灭净对种植玉米的土壤酚类氧化酶的影响 5
3.4莠灭净对种植苜蓿的土壤酚类氧化酶的影响 6
3.5莠灭净对种植不同植物的土壤酚类氧化酶的影响 6
3.6 莠灭净在土壤中的残留量 7
4 讨论 8
5 不足与展望 8
致谢 9
参考文献 9
莠灭净对植物根系土壤中酚类氧化酶活性的影响
引言
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