纳米棒的电致化学发光能量共振转移法用于前列腺抗原的检测
摘要：本论文提出了一种新型检测前列腺特异性抗原(PSA)的生物传感器，该传感器基于电致化学发光(ECL)——能量共振转移(RET)法，具有简便、灵敏度高的优点。该体系由多壁碳纳米管(MWCNT)、聚酰胺型树枝状聚合物(PAMAM)、金纳米颗粒(NPs)组成，修饰在玻碳电极(GCE)表面，以促进电子转移、提供大量的胺基用于生物分子的固定、扩大ECL信号。由于Ru(bpy)32+的发射光谱与金纳米棒的吸收光谱能产生较好的重叠，在电极表面修饰金纳米棒(Au NRs)标记的多肽后，ECL信号能产生明显下降。当多肽被前列腺抗原剪切后，金纳米棒和多肽从电极表面释放，ECL信号得到极大的恢复。该方法对前列腺抗原检测的线性范围为0.1 pg/mL~10 ng/mL。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 仪器及试剂 2
1.1.1 实验仪器 2
1.1.2 实验药品 3
1.2 材料的制备 3
1. 2. 1 Au NPs (5nm)的制备 3
1.2.2 Au NRs与多肽Au NRs的制备 3
1.3 实验方法 3
1.3.1 制备Au NPs/PAMAM/MWCNTs混合物修饰玻碳电极 3
1.3.2 ECL生物传感器的组装 3
2 结果与分析 4
2.1 Au/PAMAM/MWCNTs复合膜修饰电极的表征 4
2.2 Au NRs的表征 5
2.3 ECL传感器的原理 5
2.4 实验条件的优化 7
2.5 传感器在PSA检测中的分析性能 7
3 结论 8
致谢 8
参考文献： 8
基于纳米棒的电致化学发光——能量共振转移法用于前列腺抗原的检测
引言
引言
简单、灵敏度高的肿瘤标志物检测方法的发展在早期诊断和在临床和生物分析领域的癌症复发方面引起了很高的关注。到目前为止，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
癌症标志物的定量分析主要依赖于传统的免疫分析方法[14]、适体检测[5]和多肽测定[6,7]。其中，基于多肽的测定已被广泛采用。与抗体和核酸适体相比，多肽检测由于其特异性高，毒性低，性价比高，易于修饰等优点，具有良好的发展前景[810]。Li等人发明了一种构象形成/变形的肿瘤侵袭性生物标志物的电化学检测方法[11]。Qi等人提出了一种新的电化学发光肽生物传感器，用于前列腺抗原的检测，该方法基于前列腺抗原诱导肽裂解，使二茂铁从电极表面分离，从而导致钌联吡啶的发光信号恢复[12]。由于目前大多数以多肽为基础的分析都是基于构象或距离的变化而进行的，而共振能量转移作为一种用于探测这些变化的分子检测技术，还未被用于肽测定。
当供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠时，会发生能量共振转移，这可被用于制备基于分子间距离和构象变化的分子开关。近年来，电致化学发光(ECL)与能量共振转移(RET)的结合得到了广泛的关注，该技术具有发光信号强烈、没有受体的背景干扰、不需要外部光源等优点。研究表明，ECLRET是一种用来研究生物分子和肿瘤细胞之间相互作用的高灵敏度的检测方法，在癌症标志物的检测中显示出巨大的应用前景[1316]。为了提高ECLRET的灵敏度，可以采用不同尺寸、不同形状的受体，如Au NPs[17,18]、Au NRs[19]、核壳结构的Au@Ag2S NPs[20]等，这是因为这些受体的吸收光谱易于调整。此前，我们以 Au@ Ag2S NPs 为受体，氧化石墨烯Au/RuSi@Ru(bpy)32+为供体，实现敏感DNA的检测[20]。然而至今为止，很少有人关注供体发光强度的提高，因此，我们要致力于提高ECLRET体系的分析性能。
聚酰胺型树枝状聚合物(PAMAM)是一种超支化、具有高密度表面活性基团的三维结构，由于其特殊的性质，常用于制备多功能生物传感器[21,22]。Jie等人通过PAMAM上的多功能胺组，在PAMAM上沉积大量CdSeZnS量子点，使电化学发光信号得到显著提高[23]。然而，材料导电性差、表面具有大量的正电荷，限制了其在Ru(bpy)32+电化学发光分析中的进一步应用。因此，一些研究着力于提高其电导性和放大电化学发光信号。例如，将大量的Au纳米颗粒或Pt纳米颗粒包裹在PAMAM树状大分子内，并修饰在电极表面，以增强Ru(bpy)32+的电化学发光信号[24]。除此之外，PAMAM树状大分子还可以与石墨烯混合，促进电子转移、加强生物传感器的多价态识别效率[22]。
在本论文中，我们提出一种用于肿瘤标志物检测的ECLRET生物传感器，该传感器基于Au NPs/ PAMAM/ MWCNTs膜的放大效应和蛋白诱导多肽Au NRs在电极表面的裂解。在这个实验中，我们以PSA为模型分析物。氨基化的PAMAM树状大分子和多壁碳纳米管混合，然后修饰玻碳电极表面，这不仅有利于电子的转移，还为生物分子的固定提供较大的比表面积。然而，带正电的PAMAM树状大分子会阻碍带相同电荷的Ru(bpy)32+到达电极表面，从而导致ECL信号明显减弱。因此，我们在其中加入Au NPs，ECL信号得到明显增强。然后，将Au NRs标记的多肽修饰在Au NPs/ PAMAM/ MWCNTs 表面，组成ECLRET生物传感器。由于Ru(bpy)32+的发射光谱与Au NRs的吸收光谱发生重叠，两者之间可进行有效的能量转移，导致ECL信号明显降低。当PSA存在时，多肽Au NRs被PSA裂解后，ECL信号得到极大的恢复。这种生物传感器可以避免“假阳性”的结果，是一种高灵敏度的肿瘤标志物检测方法。
1 材料与方法
1.1 仪器及试剂
1.1.1 实验仪器
本实验中所使用的设备如表11所示：
表11 实验仪器一览表
Table 1.1 Equipments for the experiments
仪器
型号
产地/厂家
电化学分析仪
MPIE
西安瑞迈分析仪器有限责任公司
透射电子显微镜
JEM200CX
日本JEOL公司
pH计
PB21
德国Sartorius公司
电化学工作站
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 仪器及试剂 2
1.1.1 实验仪器 2
1.1.2 实验药品 3
1.2 材料的制备 3
1. 2. 1 Au NPs (5nm)的制备 3
1.2.2 Au NRs与多肽Au NRs的制备 3
1.3 实验方法 3
1.3.1 制备Au NPs/PAMAM/MWCNTs混合物修饰玻碳电极 3
1.3.2 ECL生物传感器的组装 3
2 结果与分析 4
2.1 Au/PAMAM/MWCNTs复合膜修饰电极的表征 4
2.2 Au NRs的表征 5
2.3 ECL传感器的原理 5
2.4 实验条件的优化 7
2.5 传感器在PSA检测中的分析性能 7
3 结论 8
致谢 8
参考文献： 8
基于纳米棒的电致化学发光——能量共振转移法用于前列腺抗原的检测
引言
引言
简单、灵敏度高的肿瘤标志物检测方法的发展在早期诊断和在临床和生物分析领域的癌症复发方面引起了很高的关注。到目前为止，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
癌症标志物的定量分析主要依赖于传统的免疫分析方法[14]、适体检测[5]和多肽测定[6,7]。其中，基于多肽的测定已被广泛采用。与抗体和核酸适体相比，多肽检测由于其特异性高，毒性低，性价比高，易于修饰等优点，具有良好的发展前景[810]。Li等人发明了一种构象形成/变形的肿瘤侵袭性生物标志物的电化学检测方法[11]。Qi等人提出了一种新的电化学发光肽生物传感器，用于前列腺抗原的检测，该方法基于前列腺抗原诱导肽裂解，使二茂铁从电极表面分离，从而导致钌联吡啶的发光信号恢复[12]。由于目前大多数以多肽为基础的分析都是基于构象或距离的变化而进行的，而共振能量转移作为一种用于探测这些变化的分子检测技术，还未被用于肽测定。
当供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠时，会发生能量共振转移，这可被用于制备基于分子间距离和构象变化的分子开关。近年来，电致化学发光(ECL)与能量共振转移(RET)的结合得到了广泛的关注，该技术具有发光信号强烈、没有受体的背景干扰、不需要外部光源等优点。研究表明，ECLRET是一种用来研究生物分子和肿瘤细胞之间相互作用的高灵敏度的检测方法，在癌症标志物的检测中显示出巨大的应用前景[1316]。为了提高ECLRET的灵敏度，可以采用不同尺寸、不同形状的受体，如Au NPs[17,18]、Au NRs[19]、核壳结构的Au@Ag2S NPs[20]等，这是因为这些受体的吸收光谱易于调整。此前，我们以 Au@ Ag2S NPs 为受体，氧化石墨烯Au/RuSi@Ru(bpy)32+为供体，实现敏感DNA的检测[20]。然而至今为止，很少有人关注供体发光强度的提高，因此，我们要致力于提高ECLRET体系的分析性能。
聚酰胺型树枝状聚合物(PAMAM)是一种超支化、具有高密度表面活性基团的三维结构，由于其特殊的性质，常用于制备多功能生物传感器[21,22]。Jie等人通过PAMAM上的多功能胺组，在PAMAM上沉积大量CdSeZnS量子点，使电化学发光信号得到显著提高[23]。然而，材料导电性差、表面具有大量的正电荷，限制了其在Ru(bpy)32+电化学发光分析中的进一步应用。因此，一些研究着力于提高其电导性和放大电化学发光信号。例如，将大量的Au纳米颗粒或Pt纳米颗粒包裹在PAMAM树状大分子内，并修饰在电极表面，以增强Ru(bpy)32+的电化学发光信号[24]。除此之外，PAMAM树状大分子还可以与石墨烯混合，促进电子转移、加强生物传感器的多价态识别效率[22]。
在本论文中，我们提出一种用于肿瘤标志物检测的ECLRET生物传感器，该传感器基于Au NPs/ PAMAM/ MWCNTs膜的放大效应和蛋白诱导多肽Au NRs在电极表面的裂解。在这个实验中，我们以PSA为模型分析物。氨基化的PAMAM树状大分子和多壁碳纳米管混合，然后修饰玻碳电极表面，这不仅有利于电子的转移，还为生物分子的固定提供较大的比表面积。然而，带正电的PAMAM树状大分子会阻碍带相同电荷的Ru(bpy)32+到达电极表面，从而导致ECL信号明显减弱。因此，我们在其中加入Au NPs，ECL信号得到明显增强。然后，将Au NRs标记的多肽修饰在Au NPs/ PAMAM/ MWCNTs 表面，组成ECLRET生物传感器。由于Ru(bpy)32+的发射光谱与Au NRs的吸收光谱发生重叠，两者之间可进行有效的能量转移，导致ECL信号明显降低。当PSA存在时，多肽Au NRs被PSA裂解后，ECL信号得到极大的恢复。这种生物传感器可以避免“假阳性”的结果，是一种高灵敏度的肿瘤标志物检测方法。
1 材料与方法
1.1 仪器及试剂
1.1.1 实验仪器
本实验中所使用的设备如表11所示：
表11 实验仪器一览表
Table 1.1 Equipments for the experiments
仪器
型号
产地/厂家
电化学分析仪
MPIE
西安瑞迈分析仪器有限责任公司
透射电子显微镜
JEM200CX
日本JEOL公司
pH计
PB21
德国Sartorius公司
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