利用彗星实验研究西维因对雄性尼罗罗非鱼的遗传毒性
西维因是具有一定遗传毒性和雌激素效应的氨基甲酸酯类杀虫剂。本试验利用彗星实验以雄性的尼罗罗非鱼为研究对象，探讨不同浓度下西维因的暴露对罗非鱼精巢的DNA损伤。罗非鱼暴露在不同剂量下的西维因下（0.16mg/L、0.8mg/L、2mg/L）为期29天，西维因暴露第10天、19天、29天，采取罗非鱼的精巢组织，利用单细胞凝胶电泳技术立即测定西维因对精巢DNA的损伤。精巢DNA的损伤程度随着暴露时间的增加逐渐加剧，在暴露第29天，DNA损伤最为严重。研究表明一定浓度范围内的西维因对DNA的损伤存在剂量-效应关系和时间-效应关系，中高剂量西维因组差异不显著，西维因对雄性的罗非鱼精巢组织具有遗传毒性。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料与试剂 2
1.2 实验仪器 3
1.3 实验设计 3
1.4 彗星试验 3
1.4.1制备单细胞悬浮液 3
1.4.2 制片 3
1.4.3 细胞裂解 3
1.4.4 DNA解旋 3
1.4.5 电泳 3
1.4.6 中和 4
1.4.7 固定 4
1.4.8 染色 4
1.5 统计分析 4
2 结果与分析 4
2.1 精巢细胞DNA受损状况 4
2.2 西维因对精巢细胞DNA的损伤作用 4
3 讨论 6
4 小结 7
结论 7
致谢 7
参考文献 8
利用彗星实验研究西维因对罗非鱼的遗传毒性
引言
西维因（carbaryl），学名：1萘基N甲基氨基甲酸酯，也被称为甲萘威，是世界上首先被广泛使用的商品化氨基甲酸酯类杀虫剂。可以应用在141种作物上，能防治大约565种害虫。西维因属于中、低毒性的农药，而且其毒性与pH有较大关联，水体pH为4时毒性最大，中性及碱性条件下具有相同的毒性。西维因具有神经毒性, 主要毒性作用机制是通过拮抗乙酰胆 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
碱酯酶活性，迫使乙酰胆碱在突触间隙蓄积，产生神经毒性，引发相应的功能障碍。但该神经毒性在96小时内能够恢复，是可逆的。
徐晋康[1]等选鼠作受试动物，经实验发现，鼠在中毒初期出现兴奋，随即出现抑制，伴有肌肉抽搐，瞳孔缩小等症状。重度中毒鼠一般在2 h内死亡；轻度中毒鼠多数于l h内症状就消失并逐渐恢复，毒性数据随着动物体性别及个体差异有少许差别。Punzo[2]研究证实不同浓度的西维因导致大鼠的异常活动也存在差异，而且西维因浓度的增高，对鼠的行为约束也越大，首先表现在会四处疯狂乱窜，随后速度变慢渐渐安静下来，较低浓度的西维因对大鼠行为活动影响不明显。未成年鱼对西唯因的毒性敏感度大于成年鱼。Boran[3]研究发现高浓度西维因的暴露会导致鱼鳃部出现零散的薄片状增生区域，肝、肾及脾发生病变乃至坏死。不同物种对西维因的抗毒能力表现不一样，同一物种不同生命阶段的抗毒能力也不同，一般表现为成体的抗毒能力比幼体强。
西维因毒性积累的靶器官一般为脂肪组织和肝脏。Duke[4]通过生化和组织学的分析，观察发现通过西维因暴露实验的肝细胞会出现不同程度的液泡化和肥大，高浓度西维因的暴露导致虹鳟鱼鳃部出现了零散的薄片状增生区域，肝、肾及脾发生病变乃至坏死。NADPH细胞色素C还原酶活性明显降低[5]，同时细胞的线粒体也出现了不良变化，验证了西维因对肝脏有损害功能。西唯因在一定程度上阻碍了胆固醇通过线粒体膜的过程，同时也影响环腺苷酸（cAMP）的减少[6]。在一定浓度的西维因暴露下,罗非鱼的肝组织发生了病变,超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽转移酶（GST）等酶活性均受到抑制[7]。通过观察鱼体游泳活动和鳃盖开合的节拍等行为特征，侧面反映出西维因对鱼体毒性的强弱[8]，并发现西维因浓度影响到生物分布，特别是会改变动物产卵位置的选择，破坏生物周围的生活环境，如捕食环境。在有西维因分布的区域，雨蛙的产卵量比无西维因成分分布的区域明显减少，繁殖力显著降低[9]。此外，高浓度的西维因具有引起机体致畸、致癌、致突变的作用。西维因进入人体后通过抑制人体的内部器官如脑、肝，肾脏、性腺等组织内酶的活性来危害人体健康。长期接触西维因的工人患有头痛，神经衰弱，肌肉痉挛等症状，并且该症状随着暴露时间的延长不断加剧[10]。
单细胞凝胶电泳技术（Single cell gel electrophoresis，SCGE）又名彗星实验（Comet assay），是一种简便、快速、灵敏的检测单个细胞DNA断裂的新技术方法。其原理是在细胞裂解液的作用下，细胞的细胞膜、核膜等生物膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA及其他成分进入琼脂糖中，从而扩散到细胞裂解液中，DNA则由于其高分子量留在原位。在pH大于13的碱性电泳液的作用下，DNA双链开始解旋，未受损的核DNA保持原状，形似球状，无拖尾现象。分子量较小的受损DNA片段，在电泳的过程中会不断离开核DNA，向阳极迁移，形成彗星状拖尾，DNA损伤越严重断链及碱易变性片段越多，断链越来越小，电泳过程中，向阳极迁移的DNA量越多，迁移距离越长。通过荧光染色剂染色，荧光显微镜下观察并拍照，分析其尾部DNA含量（TDNA%）、尾长（TL）、尾矩（TM）、Olive尾矩（OTM），从而判断细胞DNA的受损程度。
单细胞凝胶电泳技术因其灵敏度高、简易方便等优势，广泛的应用于遗传毒理学检测过程中。厉以强[11]等人利用单细胞凝胶电泳技术研究暴露在氨基酚下的鲤鱼肾细胞DNA的损伤情况，发现DNA的损伤随剂量的增加而严重。薛良义等应用彗星实验表明了氯苯和硝基苯的暴露会引起鲫鱼血细胞DNA单链的断裂，出现DNA拖尾，且拖尾比例和严重程度随着剂量的升高而升高，明显呈现剂量效应关系。张旭红[12]等利用单细胞凝胶电泳技术发现，将植物根尖直接暴露在受污染的土壤和水中，镉污染土壤和水体能引起植物基因组的损伤，甚至有可能会通过植物果实向食物链的上游传递，对生物链造成不小危害。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料与试剂 2
1.2 实验仪器 3
1.3 实验设计 3
1.4 彗星试验 3
1.4.1制备单细胞悬浮液 3
1.4.2 制片 3
1.4.3 细胞裂解 3
1.4.4 DNA解旋 3
1.4.5 电泳 3
1.4.6 中和 4
1.4.7 固定 4
1.4.8 染色 4
1.5 统计分析 4
2 结果与分析 4
2.1 精巢细胞DNA受损状况 4
2.2 西维因对精巢细胞DNA的损伤作用 4
3 讨论 6
4 小结 7
结论 7
致谢 7
参考文献 8
利用彗星实验研究西维因对罗非鱼的遗传毒性
引言
西维因（carbaryl），学名：1萘基N甲基氨基甲酸酯，也被称为甲萘威，是世界上首先被广泛使用的商品化氨基甲酸酯类杀虫剂。可以应用在141种作物上，能防治大约565种害虫。西维因属于中、低毒性的农药，而且其毒性与pH有较大关联，水体pH为4时毒性最大，中性及碱性条件下具有相同的毒性。西维因具有神经毒性, 主要毒性作用机制是通过拮抗乙酰胆 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
碱酯酶活性，迫使乙酰胆碱在突触间隙蓄积，产生神经毒性，引发相应的功能障碍。但该神经毒性在96小时内能够恢复，是可逆的。
徐晋康[1]等选鼠作受试动物，经实验发现，鼠在中毒初期出现兴奋，随即出现抑制，伴有肌肉抽搐，瞳孔缩小等症状。重度中毒鼠一般在2 h内死亡；轻度中毒鼠多数于l h内症状就消失并逐渐恢复，毒性数据随着动物体性别及个体差异有少许差别。Punzo[2]研究证实不同浓度的西维因导致大鼠的异常活动也存在差异，而且西维因浓度的增高，对鼠的行为约束也越大，首先表现在会四处疯狂乱窜，随后速度变慢渐渐安静下来，较低浓度的西维因对大鼠行为活动影响不明显。未成年鱼对西唯因的毒性敏感度大于成年鱼。Boran[3]研究发现高浓度西维因的暴露会导致鱼鳃部出现零散的薄片状增生区域，肝、肾及脾发生病变乃至坏死。不同物种对西维因的抗毒能力表现不一样，同一物种不同生命阶段的抗毒能力也不同，一般表现为成体的抗毒能力比幼体强。
西维因毒性积累的靶器官一般为脂肪组织和肝脏。Duke[4]通过生化和组织学的分析，观察发现通过西维因暴露实验的肝细胞会出现不同程度的液泡化和肥大，高浓度西维因的暴露导致虹鳟鱼鳃部出现了零散的薄片状增生区域，肝、肾及脾发生病变乃至坏死。NADPH细胞色素C还原酶活性明显降低[5]，同时细胞的线粒体也出现了不良变化，验证了西维因对肝脏有损害功能。西唯因在一定程度上阻碍了胆固醇通过线粒体膜的过程，同时也影响环腺苷酸（cAMP）的减少[6]。在一定浓度的西维因暴露下,罗非鱼的肝组织发生了病变,超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽转移酶（GST）等酶活性均受到抑制[7]。通过观察鱼体游泳活动和鳃盖开合的节拍等行为特征，侧面反映出西维因对鱼体毒性的强弱[8]，并发现西维因浓度影响到生物分布，特别是会改变动物产卵位置的选择，破坏生物周围的生活环境，如捕食环境。在有西维因分布的区域，雨蛙的产卵量比无西维因成分分布的区域明显减少，繁殖力显著降低[9]。此外，高浓度的西维因具有引起机体致畸、致癌、致突变的作用。西维因进入人体后通过抑制人体的内部器官如脑、肝，肾脏、性腺等组织内酶的活性来危害人体健康。长期接触西维因的工人患有头痛，神经衰弱，肌肉痉挛等症状，并且该症状随着暴露时间的延长不断加剧[10]。
单细胞凝胶电泳技术（Single cell gel electrophoresis，SCGE）又名彗星实验（Comet assay），是一种简便、快速、灵敏的检测单个细胞DNA断裂的新技术方法。其原理是在细胞裂解液的作用下，细胞的细胞膜、核膜等生物膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA及其他成分进入琼脂糖中，从而扩散到细胞裂解液中，DNA则由于其高分子量留在原位。在pH大于13的碱性电泳液的作用下，DNA双链开始解旋，未受损的核DNA保持原状，形似球状，无拖尾现象。分子量较小的受损DNA片段，在电泳的过程中会不断离开核DNA，向阳极迁移，形成彗星状拖尾，DNA损伤越严重断链及碱易变性片段越多，断链越来越小，电泳过程中，向阳极迁移的DNA量越多，迁移距离越长。通过荧光染色剂染色，荧光显微镜下观察并拍照，分析其尾部DNA含量（TDNA%）、尾长（TL）、尾矩（TM）、Olive尾矩（OTM），从而判断细胞DNA的受损程度。
单细胞凝胶电泳技术因其灵敏度高、简易方便等优势，广泛的应用于遗传毒理学检测过程中。厉以强[11]等人利用单细胞凝胶电泳技术研究暴露在氨基酚下的鲤鱼肾细胞DNA的损伤情况，发现DNA的损伤随剂量的增加而严重。薛良义等应用彗星实验表明了氯苯和硝基苯的暴露会引起鲫鱼血细胞DNA单链的断裂，出现DNA拖尾，且拖尾比例和严重程度随着剂量的升高而升高，明显呈现剂量效应关系。张旭红[12]等利用单细胞凝胶电泳技术发现，将植物根尖直接暴露在受污染的土壤和水中，镉污染土壤和水体能引起植物基因组的损伤，甚至有可能会通过植物果实向食物链的上游传递，对生物链造成不小危害。
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