眼柄切除对克氏原鳌虾卵巢发育成熟的影响
为分析眼柄切除对诱导克氏原螯虾卵巢发育成熟产生的影响及效应程度，本实验以克氏原鳌虾为样本，采集眼柄切除前后15天和30天两个时间点的体长、体重、螯肢长、螯长、卵巢重探究眼柄切除对个体生长和卵巢发育的影响；采用组织切片法和FEI透射电子显微镜（TEM）对卵巢微结构进行观察比较；并利用RT-PCR方法逆转录克氏原螯虾卵黄蛋白原mRNA。结果显示，眼柄切除30天后克氏原鳌虾体长有所增长，从11.5 cm增长至18.2 cm，性腺指数也从（2.31±1.6)%增长至（2.76±1.1）%，体重和螯肢长等指标也有所增长；电镜结果显示眼柄切除前后卵母细胞体积变大；液泡压缩变小；卵黄颗粒加速积累，逐渐占满整个胞内空间；滤泡细胞胞质从粘稠变稀薄，卵母细胞从发育Ⅱ期迅速从Ⅲ期过渡到Ⅵ期阶段；经琼脂糖凝胶电泳和紫外光照射，结果表明眼柄切除后卵巢细胞卵黄蛋白原mRNA表达量显著增长。本研究为揭示克氏原螯虾卵巢发育的级联调控机制提供理论基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．2 单侧眼柄切除 3
1．3 组织切片样品制备 3
1．4 一步RTPCR 3
1．4．1 卵巢组织总RNA提取 3
1．4．2 引物的合成和设计 3
1．4．3 一步RTPCR总体系 3
1．4．4 一步RTPCR反应条件 3
2 结果与分析 4
2．1 单侧眼柄切除前后克氏原鳌虾形态与卵巢分期的变化 4
2．1．1 克氏原鳌虾形态变化 4
2．1．2 克氏原鳌虾卵巢发育和分期变化 4
2．2 眼柄切除前后透射电镜观察比较 4
2．3 眼柄切除前后卵黄蛋白原的表达量 5
2．3．1 总RNA 纯度和完整性 5
2．3．2 PCR电泳结果 5
3 讨论 5
致谢 6
参考文献： 6
图版： 7
眼柄切除对克氏 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
原鳌虾卵巢发育成熟的影响
引言
克氏原鳌虾（Procambarus clarkii），英文名为Red Swamp Crayfish或Red Crawfish俗称小龙虾，在分类上属动物界（Animalia)、节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、爬行亚目(Reptantia)、鳌虾科(Cambaridae)、原鳌虾属(Procambarus)，原产于南美洲，二十世纪二三十年代由日本传入中国，并最终归化成为我国自然水体中的一个种[1]，由于克氏原鳌虾生长迅速，抗病力和攻击力较强，对我国本土物种造成巨大威胁，尤其是中华绒螯蟹和青虾，很长一段时间，克氏原鳌虾在我国被作为有害入侵物种被清除[2]，随着消费量的增加，克氏原鳌虾的经济价值和营养价值逐渐被人们认识；欧美国家对于克氏原鳌虾的消费量大，但自给能力不足，有很大一部分依靠进口[3]，而我国是克氏原鳌虾生产和出口大国，并随着我国水产养殖标准化体系的建立和完善，将会大大促进克氏原鳌虾在我国的消费量和出口贸易，国内外市场前景广阔；克氏原鳌虾头壳占体重的81%，其中富含占全虾约80%的游离氨基酸和90%以上的微量元素[4]，其提取的甲壳质，可用作手术缝合线、人造皮肤和人造血管等原材料与甲壳中提取的甲壳素在医药、食品和工业等方面应用广泛[5]；肌肉嫩而鲜美，蛋白质含量高于大多数淡海水鱼虾，氨基酸含量高，脂肪含量低，利于人体吸收，且含多种人体所需的不饱和脂肪酸[6]。克氏原鳌虾巨大的市场潜力使捕捞力度加大，长此以往，自然资源的日益不足要由人工养殖来补充日益增大的市场消费量，这就提高了养殖户的热情，但人工养殖的克氏原鳌虾卵巢发育不同步，规格不齐，影响经济效益。
甲壳动物眼柄处存在神经内分泌调控中心，称为X器官窦腺复合体（Xorgan sinus gland,XOSG），分泌高血糖激素家族（Crustacean hyperglycemic hormine family,CHH家族)[7,8]，直接或间接影响甲壳动物的性腺发育，其中性腺抑制激素（Gonadinhibiting hormone,GIH)对于甲壳动物的性腺发育有着直接的抑制作用，抑制肝胰腺合成卵黄和卵巢细胞对卵黄蛋白的积累，故又称卵黄抑制激素（Vitellogensis inhibiting bormone,VIH），切除眼柄能够解除其对性腺发育的抑制作用；吴超[9]等对日本囊对虾分为眼柄切除组与对照组相比性腺指数（GSI）显著上升，这与殷海成[10]利用克氏原鳌虾做样本的实验得到的结果相同，眼柄的切除能够加快性腺发育。
克氏原鳌虾雌体在卵巢发育过程中会产生卵黄蛋白（Vitellin,Vn)，是卵黄的主要成分，为克氏原鳌虾幼体发育提供营养，卵黄的积累是卵母细胞发育成熟的前提条件，卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)是卵黄磷蛋白的前体，在卵黄发生期迅速积累，而卵黄磷蛋白是卵黄蛋白的主要成分。在卵巢发育过程中卵巢自身合成内源性卵黄蛋白或由肝胰腺外源性合成卵黄蛋白原，并通过胞吞方式进入卵母细胞并被修饰成卵黄相关蛋白发挥营养作用[11]。大颚器官（Mandibular organ,MO）是另一个神经内分泌调控中心受CHH家族中的大颚器抑制激素（Mandibular organinhibiting hormone,MOIH）的调控，许多实验证明，大颚器合成分泌的甲基法尼酯（Methyl farnesoate,MF）有促进卵黄发生的功能，Rodriguez等[12]给鳌虾单独注射甲基法尼酯或与1β雌二醇混合注射，可明显促进鳌虾的性腺发育；李胜等[13]对克氏原鳌虾卵巢发育阶段和大颚器的发育阶段进行对比，发现大颚器随着卵巢的发育而变化，其与促进卵巢发育尤其是卵黄发生的生理功能有关系。
本实验探究眼柄的切除对克氏原鳌虾体重、体长等指标和卵巢发育的影响；利用组织切片和透射电镜技术观察眼柄切除前后克氏原鳌虾卵母细胞的形态特征的变化；运用RTPCR技术探究眼柄切除前后克氏原鳌虾卵巢卵黄蛋白原的表达量的变化。
1 材料与方法
1．1 材料
克氏原螯虾雌性幼虾购自南方泉菜市场。选取雌性、体质健壮、活动力强、附肢完整的幼虾65尾，体长8.9—12.3 cm，体重13.5—27.6 g。实验室条件下暂养于水箱中，全天供氧，水温为27～29℃，每周换水2／3，每天投饲2次（8：00和16：00），日投饲率为2％。
1．2 单侧眼柄切除
试验虾在实验室暂养，待活动和摄食趋于正常后，随机分成5个组，A0（养殖0d）对照组（A1组、A2组）和处理组（B1组、B2组），每组15尾，统计体长和体重等指标。随后处理组用医用中号镊子，经酒精灯烧红，对雌虾右侧眼柄进行烫伤摘除，处理30 s。对照组只具备与处理组相同的实验环境，无其它任何处理。眼柄切除15 天后，对照组A1和处理组B1终止喂养，全部样本统计体长、体重及卵巢分期和重量等指标；眼柄切除30 天后，对照组A2和处理组B2终止喂养，统计同上。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．2 单侧眼柄切除 3
1．3 组织切片样品制备 3
1．4 一步RTPCR 3
1．4．1 卵巢组织总RNA提取 3
1．4．2 引物的合成和设计 3
1．4．3 一步RTPCR总体系 3
1．4．4 一步RTPCR反应条件 3
2 结果与分析 4
2．1 单侧眼柄切除前后克氏原鳌虾形态与卵巢分期的变化 4
2．1．1 克氏原鳌虾形态变化 4
2．1．2 克氏原鳌虾卵巢发育和分期变化 4
2．2 眼柄切除前后透射电镜观察比较 4
2．3 眼柄切除前后卵黄蛋白原的表达量 5
2．3．1 总RNA 纯度和完整性 5
2．3．2 PCR电泳结果 5
3 讨论 5
致谢 6
参考文献： 6
图版： 7
眼柄切除对克氏 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
原鳌虾卵巢发育成熟的影响
引言
克氏原鳌虾（Procambarus clarkii），英文名为Red Swamp Crayfish或Red Crawfish俗称小龙虾，在分类上属动物界（Animalia)、节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、爬行亚目(Reptantia)、鳌虾科(Cambaridae)、原鳌虾属(Procambarus)，原产于南美洲，二十世纪二三十年代由日本传入中国，并最终归化成为我国自然水体中的一个种[1]，由于克氏原鳌虾生长迅速，抗病力和攻击力较强，对我国本土物种造成巨大威胁，尤其是中华绒螯蟹和青虾，很长一段时间，克氏原鳌虾在我国被作为有害入侵物种被清除[2]，随着消费量的增加，克氏原鳌虾的经济价值和营养价值逐渐被人们认识；欧美国家对于克氏原鳌虾的消费量大，但自给能力不足，有很大一部分依靠进口[3]，而我国是克氏原鳌虾生产和出口大国，并随着我国水产养殖标准化体系的建立和完善，将会大大促进克氏原鳌虾在我国的消费量和出口贸易，国内外市场前景广阔；克氏原鳌虾头壳占体重的81%，其中富含占全虾约80%的游离氨基酸和90%以上的微量元素[4]，其提取的甲壳质，可用作手术缝合线、人造皮肤和人造血管等原材料与甲壳中提取的甲壳素在医药、食品和工业等方面应用广泛[5]；肌肉嫩而鲜美，蛋白质含量高于大多数淡海水鱼虾，氨基酸含量高，脂肪含量低，利于人体吸收，且含多种人体所需的不饱和脂肪酸[6]。克氏原鳌虾巨大的市场潜力使捕捞力度加大，长此以往，自然资源的日益不足要由人工养殖来补充日益增大的市场消费量，这就提高了养殖户的热情，但人工养殖的克氏原鳌虾卵巢发育不同步，规格不齐，影响经济效益。
甲壳动物眼柄处存在神经内分泌调控中心，称为X器官窦腺复合体（Xorgan sinus gland,XOSG），分泌高血糖激素家族（Crustacean hyperglycemic hormine family,CHH家族)[7,8]，直接或间接影响甲壳动物的性腺发育，其中性腺抑制激素（Gonadinhibiting hormone,GIH)对于甲壳动物的性腺发育有着直接的抑制作用，抑制肝胰腺合成卵黄和卵巢细胞对卵黄蛋白的积累，故又称卵黄抑制激素（Vitellogensis inhibiting bormone,VIH），切除眼柄能够解除其对性腺发育的抑制作用；吴超[9]等对日本囊对虾分为眼柄切除组与对照组相比性腺指数（GSI）显著上升，这与殷海成[10]利用克氏原鳌虾做样本的实验得到的结果相同，眼柄的切除能够加快性腺发育。
克氏原鳌虾雌体在卵巢发育过程中会产生卵黄蛋白（Vitellin,Vn)，是卵黄的主要成分，为克氏原鳌虾幼体发育提供营养，卵黄的积累是卵母细胞发育成熟的前提条件，卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)是卵黄磷蛋白的前体，在卵黄发生期迅速积累，而卵黄磷蛋白是卵黄蛋白的主要成分。在卵巢发育过程中卵巢自身合成内源性卵黄蛋白或由肝胰腺外源性合成卵黄蛋白原，并通过胞吞方式进入卵母细胞并被修饰成卵黄相关蛋白发挥营养作用[11]。大颚器官（Mandibular organ,MO）是另一个神经内分泌调控中心受CHH家族中的大颚器抑制激素（Mandibular organinhibiting hormone,MOIH）的调控，许多实验证明，大颚器合成分泌的甲基法尼酯（Methyl farnesoate,MF）有促进卵黄发生的功能，Rodriguez等[12]给鳌虾单独注射甲基法尼酯或与1β雌二醇混合注射，可明显促进鳌虾的性腺发育；李胜等[13]对克氏原鳌虾卵巢发育阶段和大颚器的发育阶段进行对比，发现大颚器随着卵巢的发育而变化，其与促进卵巢发育尤其是卵黄发生的生理功能有关系。
本实验探究眼柄的切除对克氏原鳌虾体重、体长等指标和卵巢发育的影响；利用组织切片和透射电镜技术观察眼柄切除前后克氏原鳌虾卵母细胞的形态特征的变化；运用RTPCR技术探究眼柄切除前后克氏原鳌虾卵巢卵黄蛋白原的表达量的变化。
1 材料与方法
1．1 材料
克氏原螯虾雌性幼虾购自南方泉菜市场。选取雌性、体质健壮、活动力强、附肢完整的幼虾65尾，体长8.9—12.3 cm，体重13.5—27.6 g。实验室条件下暂养于水箱中，全天供氧，水温为27～29℃，每周换水2／3，每天投饲2次（8：00和16：00），日投饲率为2％。
1．2 单侧眼柄切除
试验虾在实验室暂养，待活动和摄食趋于正常后，随机分成5个组，A0（养殖0d）对照组（A1组、A2组）和处理组（B1组、B2组），每组15尾，统计体长和体重等指标。随后处理组用医用中号镊子，经酒精灯烧红，对雌虾右侧眼柄进行烫伤摘除，处理30 s。对照组只具备与处理组相同的实验环境，无其它任何处理。眼柄切除15 天后，对照组A1和处理组B1终止喂养，全部样本统计体长、体重及卵巢分期和重量等指标；眼柄切除30 天后，对照组A2和处理组B2终止喂养，统计同上。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/scyz/80.html
