福瑞鲤βcatenin基因的分子克隆和组织表达分析
β-catenin基因是细胞内的一种分布广泛的多功能蛋白，不仅影响的运动和黏附，而且也是Wnt(wingless/int)信号通路中的重要分子。本试验以福瑞鲤（Cyprinus carpio）为研究对象，采用 RT-PCR 和 cDNA 末端快速扩增（RACE）技术，首次克隆得到全长为3342 bp的β-catenin 基因，其包含一个长度为2343 bp 的开放阅读框（ORF），可编码780个氨基酸；5’非编码区（Untranslated region，UTR）为215 bp，3’ UTR 为 785 bp，其中含有28个碱基的poly（A)。推测分子质量和理论等电点分别为85.5 kDa 和5.52。同源性分析显示，福瑞鲤β-catenin基因与其他物种的同源性很高，其中与鲫鱼(Carassius auratus)和斑马鱼(Danio rerio)的β-catenin基因同一性达到99%。不同物种β-catenin基因系统进化树分析显示，福瑞鲤β-catenin基因首先和鲫鱼（Carassius auratus）聚为一支，之后和斑马鱼聚类，最后与文昌鱼（Branchiostoma belcheri）和栉孔扇贝（Azumapecten farreri）聚类。半定量 RT-PCR和实时荧光定量(RT-qPCR) 结果显示，β-catenin基因在正常福瑞鲤组织中均有表达，但在性腺和血液表达量较高，在皮肤、脾脏和肠、肾脏、肝脏、脑和心脏表达量较低，在肌肉中表达量最低。在福瑞鲤不同性腺发育阶段，β-catenin基因在七月份卵巢中表达量最高。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1实验用鱼3
1.1.2实验仪器与试剂3
1.2方法 3
1.2.1 RNA提取和cDNA获得3
1.2.2引物设计合成4
1.2.3 βcatenin基因的克隆4
1.2.4 βcatenin基因的生物信息学分析4
1.2.5 βcatenin基因的组织表达分析4
2结果与分析5
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
/> 2.1福瑞鲤βcatenin基因cDNA全长及序列分析5
2.2福瑞鲤βcatenin氨基酸同源性和系统进化树分析6
2.3福瑞鲤βcatenin基因的组织表达分析7
3讨论 8
3.1福瑞鲤βcatenin在进化上较为保守 8
3.2福瑞鲤βcatenin能在较多组织中表达 9
3.3福瑞鲤βcatenin在性腺中的功能可能较为保守 9
致谢10
参考文献10
表1福瑞鲤βcatenin基因所需引物4
图1福瑞鲤βcatenin 全长cDNA 及推导的氨基酸序列5
图2不同物种 βcatenin 蛋白的同源比对6
图3 βcatenin 系统进化分析7
图4a RTqPCR检测福瑞鲤βcatenin基因在各组织的表达8
图4b RTPCR检测福瑞鲤βcatenin基因在各组织的表达8
图5福瑞鲤βcatenin基因在性腺中的表达8
福瑞鲤βcatenin基因的分子克隆和组织表达分析
引言
引言
Wnt/βcatenin信号通路是一个进化上是十分保守的信号传导级联反应，其作用包括各种发育的调节以及细胞的生长与分化调节。Wnt信号通路也称为βcatenin通路，是目前研究较为深入的一条细胞内wnt信号转导路径。由Frizzled或LRP6受体、Dishevelled(Dsh/Dvl)、CKI、GSK3β、Axin、APC、β连环素、TCF/LEF(白细胞移动增强因子)等成员组成，其中βcatenin是核心组件，Axin是新发现的一种蛋白质，依细胞种类不同而称为axin或conduction，能同时与APC直接结合，并能分别与GsK3β和β连环素作，介导磷酸化从GSK3β向βcatenin转化，也是Wnt信号传导途径的负调控因子[1]。Wnt信号分子具有功能多样的特点，体现在不同物种中存在种类多样的Wnt分子类型，不同类型的分子具有不同的功能，甚至同一种类型的分子在不同的细胞中其作用也存在着较大的差别。
人类βcatenin基因CTNNB1位于3p22上，全长23.3kb共有16个外显子，编码分子量92kd的蛋白质。三个不同的基因编码(bar1，wrm1和hmp2)线虫β连环素蛋白簇[2]，因此其βcatenin蛋白簇具有多种不同的功能 [3]。研究指出，秀丽隐杆线虫表达三种βcatenin相关蛋白——BAR1、HMP2和WRM1，这三种相关蛋白在序列中存在相当大的差异，现在己经了解，BAR1和WRM1介导Wnt信号，而HMP2则与钙粘素或(连环素形成复合物，表明秀丽隐杆线虫的细胞粘附功能和信号传导功能是由不同的βcatenin蛋白完成的[4]。秀丽隐杆线虫的三种连环蛋白同族体中，BAR1通过与POP1形成二聚体，激活Wnt靶基因的表达，因此尽管其它物种βcatenin基因的突变表型和蛋白质的互作性很强，由于多种βcatenin蛋白存在，仍然保留相似的功能[3]。
βcatenin是细胞内的一种分布广泛的多功能蛋白，不仅影响细胞的运动和勃附，而且也是Wnt(wingless/int)信号通路中的重要分子。βcatenin具有双重功能，既参与构成粘附复合体，又在细胞信号转导、基因激活、凋亡抑制、细胞增殖、转移中起着关键性作用。关于βcatenin基因的研究不是很多，主要集中在人类和猪、羊等动物中。在有关人类βcatenin基因的研究中，田媛媛[5]对βcatenin基因多态性与胃癌预后分子流行病学研究，研究指出βcatenin基因作为与胚胎发育、肿瘤发生等生理病理过程密切相关的 Wnt 通路的关键成员，参与细胞间黏附以及细胞间信号传递，与肿瘤的形成和浸润、转移密不可分。而在苏娟[6]的研究中得出的结论是，Wnt/βcatenin信号通路的异常激活使细胞获得无限增殖的能力,导致肿瘤的形成，Wnt/βcatenin信号通路的活性紊乱是许多上皮来源恶性肿瘤的共同特征,在这些肿瘤中,信号通路的主要成分βcatenin或多蛋白降解复合物(APC、AXIN和GSK3P)的突变等，导致了βcatenin在细胞内的聚集及Wnt/βcatenin信号通路的激活。王晓君[7]对βcatenin通路的研究通过 βcatenin RNA 干扰和恢复表达实验，检测对细胞增殖的影响，得出βcatenin基因是miR214 的靶基因，miR214 可以通过抑制 βcatenin 通路影响肝癌生长。黄文生[8]等通过对βcatenin基因沉默抑制结肠癌SW480细胞生长的研究指出，靶向 CTNNB1 的特异性 shRNA 对结肠癌 SW480 细胞具有显著抑制细胞增殖的效应。在对人类βcatenin基因的研究中还包括βcatenin基因在人卵巢癌细胞株SKVO3中的表达[9]等。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1实验用鱼3
1.1.2实验仪器与试剂3
1.2方法 3
1.2.1 RNA提取和cDNA获得3
1.2.2引物设计合成4
1.2.3 βcatenin基因的克隆4
1.2.4 βcatenin基因的生物信息学分析4
1.2.5 βcatenin基因的组织表达分析4
2结果与分析5
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
/> 2.1福瑞鲤βcatenin基因cDNA全长及序列分析5
2.2福瑞鲤βcatenin氨基酸同源性和系统进化树分析6
2.3福瑞鲤βcatenin基因的组织表达分析7
3讨论 8
3.1福瑞鲤βcatenin在进化上较为保守 8
3.2福瑞鲤βcatenin能在较多组织中表达 9
3.3福瑞鲤βcatenin在性腺中的功能可能较为保守 9
致谢10
参考文献10
表1福瑞鲤βcatenin基因所需引物4
图1福瑞鲤βcatenin 全长cDNA 及推导的氨基酸序列5
图2不同物种 βcatenin 蛋白的同源比对6
图3 βcatenin 系统进化分析7
图4a RTqPCR检测福瑞鲤βcatenin基因在各组织的表达8
图4b RTPCR检测福瑞鲤βcatenin基因在各组织的表达8
图5福瑞鲤βcatenin基因在性腺中的表达8
福瑞鲤βcatenin基因的分子克隆和组织表达分析
引言
引言
Wnt/βcatenin信号通路是一个进化上是十分保守的信号传导级联反应，其作用包括各种发育的调节以及细胞的生长与分化调节。Wnt信号通路也称为βcatenin通路，是目前研究较为深入的一条细胞内wnt信号转导路径。由Frizzled或LRP6受体、Dishevelled(Dsh/Dvl)、CKI、GSK3β、Axin、APC、β连环素、TCF/LEF(白细胞移动增强因子)等成员组成，其中βcatenin是核心组件，Axin是新发现的一种蛋白质，依细胞种类不同而称为axin或conduction，能同时与APC直接结合，并能分别与GsK3β和β连环素作，介导磷酸化从GSK3β向βcatenin转化，也是Wnt信号传导途径的负调控因子[1]。Wnt信号分子具有功能多样的特点，体现在不同物种中存在种类多样的Wnt分子类型，不同类型的分子具有不同的功能，甚至同一种类型的分子在不同的细胞中其作用也存在着较大的差别。
人类βcatenin基因CTNNB1位于3p22上，全长23.3kb共有16个外显子，编码分子量92kd的蛋白质。三个不同的基因编码(bar1，wrm1和hmp2)线虫β连环素蛋白簇[2]，因此其βcatenin蛋白簇具有多种不同的功能 [3]。研究指出，秀丽隐杆线虫表达三种βcatenin相关蛋白——BAR1、HMP2和WRM1，这三种相关蛋白在序列中存在相当大的差异，现在己经了解，BAR1和WRM1介导Wnt信号，而HMP2则与钙粘素或(连环素形成复合物，表明秀丽隐杆线虫的细胞粘附功能和信号传导功能是由不同的βcatenin蛋白完成的[4]。秀丽隐杆线虫的三种连环蛋白同族体中，BAR1通过与POP1形成二聚体，激活Wnt靶基因的表达，因此尽管其它物种βcatenin基因的突变表型和蛋白质的互作性很强，由于多种βcatenin蛋白存在，仍然保留相似的功能[3]。
βcatenin是细胞内的一种分布广泛的多功能蛋白，不仅影响细胞的运动和勃附，而且也是Wnt(wingless/int)信号通路中的重要分子。βcatenin具有双重功能，既参与构成粘附复合体，又在细胞信号转导、基因激活、凋亡抑制、细胞增殖、转移中起着关键性作用。关于βcatenin基因的研究不是很多，主要集中在人类和猪、羊等动物中。在有关人类βcatenin基因的研究中，田媛媛[5]对βcatenin基因多态性与胃癌预后分子流行病学研究，研究指出βcatenin基因作为与胚胎发育、肿瘤发生等生理病理过程密切相关的 Wnt 通路的关键成员，参与细胞间黏附以及细胞间信号传递，与肿瘤的形成和浸润、转移密不可分。而在苏娟[6]的研究中得出的结论是，Wnt/βcatenin信号通路的异常激活使细胞获得无限增殖的能力,导致肿瘤的形成，Wnt/βcatenin信号通路的活性紊乱是许多上皮来源恶性肿瘤的共同特征,在这些肿瘤中,信号通路的主要成分βcatenin或多蛋白降解复合物(APC、AXIN和GSK3P)的突变等，导致了βcatenin在细胞内的聚集及Wnt/βcatenin信号通路的激活。王晓君[7]对βcatenin通路的研究通过 βcatenin RNA 干扰和恢复表达实验，检测对细胞增殖的影响，得出βcatenin基因是miR214 的靶基因，miR214 可以通过抑制 βcatenin 通路影响肝癌生长。黄文生[8]等通过对βcatenin基因沉默抑制结肠癌SW480细胞生长的研究指出，靶向 CTNNB1 的特异性 shRNA 对结肠癌 SW480 细胞具有显著抑制细胞增殖的效应。在对人类βcatenin基因的研究中还包括βcatenin基因在人卵巢癌细胞株SKVO3中的表达[9]等。
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