sscp检测黄鳝不同组织线粒体异质性研究
PCR-SSCP技术是基于PCR的单链构象多态性分子标记技术，先将基因PCR扩增后，再通过琼脂糖凝胶电泳将其展开，最后与DNA银染法相互配合，通过条带的显影来显示结果[1]。作为一种检测基因突变的方法，由于其简单，安全，快速的特性，自创立以来，不断被应用于不同领域的科学研究中。我们使用SSCP技术和不对称PCR扩增技术对黄鳝的五个不同组织（肝脏、肾脏、血液、肌肉、卵）的线粒体的三个基因（细胞色素C、16SrDNA、D-loop）的正链和负链部分片段进行了分析。发现不同黄鳝不同组织扩增图谱不完全相同。对扩增条带统计发现肝脏扩增条带总数最低，其余组织比较接近。但16srDNA在黄鳝肝脏中的表现比较特别，其中一个片段的负链在肝脏中无法扩增。经过几次重复以及另外取样，结果具有重复性。而且琼脂糖凝胶也发现该片段负链不对称PCR没有扩增条带。但是正常PCR扩增该片段是有正常产物的。为何会形成这种现象还有待继续探索。本研究证明了SSCP技术结合不对称PCR扩增在对线粒体异质性的研究中具有一定的应用价值。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 采样2
1.2 基因组DNA提取2
1.3 序列扩增3
1.4 电泳染色 3
2 结果4
2.1 电泳图谱4
2.2 扩增条带统计5
3 讨论5
致谢6
参考文献6
SSCP检测黄鳝不同组织线粒体异质性研究
引言
引言:黄鳝（学名：Monopterus albus）隶属于硬骨鱼纲的辐鳍亚纲，属于合鳃目、合鳃科、黄鳝属。黄鳝大部分分布于亚洲，如中国、日本、朝鲜等，在大洋洲和美洲等国家和地区也有少许存在。在中国除了西北高原外，在各个地区都有记录。是一种十分重要的淡水经济鱼类。黄鳝多是生存于河底的底栖鱼类，喜欢在池塘、沟渠、水库、稻田、湖泊和池塘等浅水区的底层中活动；经常能在石缝当中，漂浮于水面的水草当中以及各种缝隙之中见到它们。它们也会在有机物含量丰富的底泥之中打洞穴居。由于其生存环境都是各种污染物富集 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
的地方，所以黄鳝对污染物的耐受性相对较高[2]。
线粒体是鱼类细胞的重要细胞器，是能量生成场所，通过氧化磷酸化为有机体提供90％ 的ATP能源，除此之外在细胞凋亡和死亡中也发挥重要作用。因此在生物的生长、发育、代谢、衰老、疾病、死亡以及生物进化等方面都有非常重要的意义[3]。某些遗传性疾病也与线粒体有关。所以以探讨黄蟮对污染物耐受性的机制线粒体是首选研究目标。线粒体DNA是一个环形的裸露在外的基因分子，由于其裸露在外的特性，他缺少了组蛋白的支持以及保护。而且由于呼吸链经常产生活性氧类物质，这些物质也会造成线粒体DNA的一定的突变，所以线粒体会有很高概率的突变性以及其序列也会呈现着多样性。mtDNA异质性一般指在相同的一个细胞或者相同的一个个体内会有着彼此不相同的两个mtDNA亚群，它包括了位点异质型和长度异质两种情况。位点异质性是指一个或者多个碱基的突变而造成的，长度异质性则是指线粒体基因的某一段改变而造成的[4]。在利用线粒体进行系统发育分析时，这些差异往往会被忽视。Beata Kmiec认为线粒体异质性广泛在于动植物种之中，而且有关线粒体异质性和人类疾病的关联研究在很多文献中都有报道[5]。但是线粒体异质性在鱼类的研究中却基本是一个空白。
PCR是根据DNA在一定温度下会变性，恢复温度时会复性以及它独特的半保留复制原理，在人工条件下扩增DNA片段的技术。它的工作过程是，先在94℃条件下变性，使双链的DNA解离形成两条单链，然后降低温度到55℃使引物于DNA模板相互结合，最后加高温度至70℃，使引物延伸。而不对称PCR使用的是不等量的一对引物，这样扩增产生的单链更加稳定。
80年代初，日本的科学家金泽在研究大肠杆菌突变F1 ATPass基因的电泳时发现，发生突变了的DNA基因片段与没有发生突变的正常DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移速率明显不同。经过深入了解后发现，2条DNA片段，即使只相差一个碱基，其电泳结果也会不同[6]。
到了1989年，日本学者Orita等经过研究发现，一个单链的DNA基因片段放大显示后看起来呈现了层层折叠的空间构象，是一种三维的立体结构。造成这种立体结构形成的原因主要是由于四种脱氧核糖核苷酸之间相互配对形成了分子间的相互作用力。这种作用力使其形成了折叠状。当其中的一个碱基发生了改变，受到分子间的配对作用力驱使，DNA片段的立体结构会或多或少的产生变化，而不同的空间构象的DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中所受阻力大小不同。所以我们可以通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将只有少许差异的DNA片段鉴定出来。这种方法被作者为单链构象多态性 (SingleStrand Conformation PolymorPhism，SSCP)分析[7]。SSCP在检测很多基因突变中有很多应用报道，但是在检测线粒体异质性还没有研究报道。
在本研究中，作者选择细胞色素C基因，16srDNA和Dloop三个序列中部分片段设计了6对引物，使用不对称PCR扩增出相应单链，对黄鳝五个组织（肝，肾，肌肉，血液和卵）的线粒体异质性进行了研究，探讨SSCP在检测线粒体异质性的应用价值。
1 材料与方法
1．1 采样
2013年11月采样，黄鳝来自中国水产科学院淡水渔业研究中心渔种场，选取一龄健康体表无破损发育正常的黄鳝，摘取其的肌肉、肝脏、肾脏、血和卵巢作为实验的基因组DNA样品。为了使实验结果更加准确无误，我们同时选取一龄建鲤作为对照，取肌肉和肝脏组织提取基因组DNA。
1.2 基因组DNA提取
取新鲜的三个组织样品各约0.1g，分别用剪刀将其剪碎，再用镊子夹入1.5ml的离心管中。每次操作完成后都要清洗使用工具，防止它们之间的DNA相互混合。然后在离心管中加入450μl STE（150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris，1mmol/L EDTA）缓冲液为DNA提供保护环境，防止其在提取中受到破坏。继续加入12.5μl的10% SDS，使蛋白质变性，从而让DNA解离出来，用10μl蛋白酶K（20mg/ml）来降解变性的蛋白质，使DNA充分游离。接着55℃消化过夜，用苯酚、氯仿各抽提一次，等体积的异丙醇（异丙醇具有减少表面张力的作用，在操作过程中会产生气泡，所以用异丙醇来减少气泡）沉淀，12000r/min离心30 分钟，沉淀用70%的乙醇洗2次，最后用30μl双蒸水溶解，在0.8%的琼脂糖凝胶上检测DNA的质量和浓度。本研究黄鳝和鲤鱼各取10个样，分别提取不同组织的基因组DNA，然后每个组织的不同样品等量混合成一个总扩增模板。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 采样2
1.2 基因组DNA提取2
1.3 序列扩增3
1.4 电泳染色 3
2 结果4
2.1 电泳图谱4
2.2 扩增条带统计5
3 讨论5
致谢6
参考文献6
SSCP检测黄鳝不同组织线粒体异质性研究
引言
引言:黄鳝（学名：Monopterus albus）隶属于硬骨鱼纲的辐鳍亚纲，属于合鳃目、合鳃科、黄鳝属。黄鳝大部分分布于亚洲，如中国、日本、朝鲜等，在大洋洲和美洲等国家和地区也有少许存在。在中国除了西北高原外，在各个地区都有记录。是一种十分重要的淡水经济鱼类。黄鳝多是生存于河底的底栖鱼类，喜欢在池塘、沟渠、水库、稻田、湖泊和池塘等浅水区的底层中活动；经常能在石缝当中，漂浮于水面的水草当中以及各种缝隙之中见到它们。它们也会在有机物含量丰富的底泥之中打洞穴居。由于其生存环境都是各种污染物富集 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
的地方，所以黄鳝对污染物的耐受性相对较高[2]。
线粒体是鱼类细胞的重要细胞器，是能量生成场所，通过氧化磷酸化为有机体提供90％ 的ATP能源，除此之外在细胞凋亡和死亡中也发挥重要作用。因此在生物的生长、发育、代谢、衰老、疾病、死亡以及生物进化等方面都有非常重要的意义[3]。某些遗传性疾病也与线粒体有关。所以以探讨黄蟮对污染物耐受性的机制线粒体是首选研究目标。线粒体DNA是一个环形的裸露在外的基因分子，由于其裸露在外的特性，他缺少了组蛋白的支持以及保护。而且由于呼吸链经常产生活性氧类物质，这些物质也会造成线粒体DNA的一定的突变，所以线粒体会有很高概率的突变性以及其序列也会呈现着多样性。mtDNA异质性一般指在相同的一个细胞或者相同的一个个体内会有着彼此不相同的两个mtDNA亚群，它包括了位点异质型和长度异质两种情况。位点异质性是指一个或者多个碱基的突变而造成的，长度异质性则是指线粒体基因的某一段改变而造成的[4]。在利用线粒体进行系统发育分析时，这些差异往往会被忽视。Beata Kmiec认为线粒体异质性广泛在于动植物种之中，而且有关线粒体异质性和人类疾病的关联研究在很多文献中都有报道[5]。但是线粒体异质性在鱼类的研究中却基本是一个空白。
PCR是根据DNA在一定温度下会变性，恢复温度时会复性以及它独特的半保留复制原理，在人工条件下扩增DNA片段的技术。它的工作过程是，先在94℃条件下变性，使双链的DNA解离形成两条单链，然后降低温度到55℃使引物于DNA模板相互结合，最后加高温度至70℃，使引物延伸。而不对称PCR使用的是不等量的一对引物，这样扩增产生的单链更加稳定。
80年代初，日本的科学家金泽在研究大肠杆菌突变F1 ATPass基因的电泳时发现，发生突变了的DNA基因片段与没有发生突变的正常DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移速率明显不同。经过深入了解后发现，2条DNA片段，即使只相差一个碱基，其电泳结果也会不同[6]。
到了1989年，日本学者Orita等经过研究发现，一个单链的DNA基因片段放大显示后看起来呈现了层层折叠的空间构象，是一种三维的立体结构。造成这种立体结构形成的原因主要是由于四种脱氧核糖核苷酸之间相互配对形成了分子间的相互作用力。这种作用力使其形成了折叠状。当其中的一个碱基发生了改变，受到分子间的配对作用力驱使，DNA片段的立体结构会或多或少的产生变化，而不同的空间构象的DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中所受阻力大小不同。所以我们可以通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将只有少许差异的DNA片段鉴定出来。这种方法被作者为单链构象多态性 (SingleStrand Conformation PolymorPhism，SSCP)分析[7]。SSCP在检测很多基因突变中有很多应用报道，但是在检测线粒体异质性还没有研究报道。
在本研究中，作者选择细胞色素C基因，16srDNA和Dloop三个序列中部分片段设计了6对引物，使用不对称PCR扩增出相应单链，对黄鳝五个组织（肝，肾，肌肉，血液和卵）的线粒体异质性进行了研究，探讨SSCP在检测线粒体异质性的应用价值。
1 材料与方法
1．1 采样
2013年11月采样，黄鳝来自中国水产科学院淡水渔业研究中心渔种场，选取一龄健康体表无破损发育正常的黄鳝，摘取其的肌肉、肝脏、肾脏、血和卵巢作为实验的基因组DNA样品。为了使实验结果更加准确无误，我们同时选取一龄建鲤作为对照，取肌肉和肝脏组织提取基因组DNA。
1.2 基因组DNA提取
取新鲜的三个组织样品各约0.1g，分别用剪刀将其剪碎，再用镊子夹入1.5ml的离心管中。每次操作完成后都要清洗使用工具，防止它们之间的DNA相互混合。然后在离心管中加入450μl STE（150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris，1mmol/L EDTA）缓冲液为DNA提供保护环境，防止其在提取中受到破坏。继续加入12.5μl的10% SDS，使蛋白质变性，从而让DNA解离出来，用10μl蛋白酶K（20mg/ml）来降解变性的蛋白质，使DNA充分游离。接着55℃消化过夜，用苯酚、氯仿各抽提一次，等体积的异丙醇（异丙醇具有减少表面张力的作用，在操作过程中会产生气泡，所以用异丙醇来减少气泡）沉淀，12000r/min离心30 分钟，沉淀用70%的乙醇洗2次，最后用30μl双蒸水溶解，在0.8%的琼脂糖凝胶上检测DNA的质量和浓度。本研究黄鳝和鲤鱼各取10个样，分别提取不同组织的基因组DNA，然后每个组织的不同样品等量混合成一个总扩增模板。
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