新型中华绒螯蟹呼肠弧病毒rtlamp检测法的建立
中华绒螯蟹呼肠孤病毒（EsRV）是导致养殖蟹严重疾病和高死亡率的病原体，为此我们建立了一个高度敏感且具有特异性的快速反转录环介导等温扩增法（RT-LAMP）。RT-LAMP比起传统的逆转录聚合酶链反应分析（RT-PCR）更便宜也更适用于养殖蟹的检测。RT-LAMP的特点是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物，利用一种链置换DNA 聚合酶在等温条件(63℃左右) 保温30－60分钟，即可完成核酸扩增反应。使用RT-LAMP法测试EsRV的最低检测极限为15pg，而且其灵敏度比常规的RT-PCR的高100倍。EsRV的LAMP扩增无需使用其他病原体菌株经行，因此具有良好的特异性。除需要通过电泳检测外，RT-LAMP法的结果可通过肉眼观察反应管浊度和钙黄绿素加入到扩增产物进行视觉检测。结果表明方便，快速，灵敏的RT-LAMP法适用于检测EsRV感染的水生生物。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
2．1 提取病毒 2
2．2 样本选取 2
2．3 RNA提取 2
2. 4 引物设计 3
2. 5 RTLAMP法检测与常规RTPCR检测 3
2. 6 RTLAMP检测法对EsRV的特异性和灵敏度 3
2. 7 临床检测 4
3 结果与分析 5
3．1 优化EsRV RTLAMP检测法 5
3．2 RTLAMP和RTPCR灵敏度检测 6
3．3 凝胶电泳检测RTLAMP的特异性 6
3．4 RTLAMP和RTPCR的适用性 6
4 讨论 7
致谢 7
参考文献 7
新型中华绒螯蟹呼肠弧病毒RTLAMP检测法的建立
引言
河蟹，学名中华绒绒螯蟹(Eriocheir sinensis）是我国养殖产量最大的淡水蟹类，二十世纪九十年代以来，养殖面积逐年增长，遍及江苏、浙江、湖北、 河北、安徽等主要淡水养殖省[1]。河蟹颤抖病 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
（tremor disease，TD），又称河蟹抖抖病、河蟹环爪病，为我国水生动物三类疫病[2]。该病于1994年在江苏省发现，随后传播至安徽、浙江、湖北等主要中华绒螯蟹养殖地[1]。病蟹的主要症状表现为步足出现明显的颤抖现象,指节变红并伴有肝部糜烂、鳃丝略黑、三角膜水肿等特征。此病一般多发生在高温季节7～9月份,并以8月份最为严重[3]。严重发病地区发病率>90%，死亡率>70%，对河蟹养殖业危害巨大。河蟹颤抖病出现已超过二十年，但有关河蟹颤抖病病原的研究一直没有权威的结论。主流报道病原有病毒和螺原体。1.病毒：报道较多的有呼肠孤样病毒（Reolike virus ），主要有呼肠孤病毒EsRV816、EsRV905[4]。这两株病毒已有部分序列，因此可以检测。报道的这两株河蟹呼肠孤病毒对河蟹的致病力低且感染后不出现河蟹颤抖病症状。另有陈辉等及贡成良等[3]也报道了呼肠孤样病毒（不同于EsRV816及EsRV905），但无序列信息；另外，还报道过河蟹小RNA病毒样病毒颗粒[5]和布尼亚样病毒（Bynyalike virus ）。非常遗憾的是有关这些病毒仅有一些很初步的研究，相关核酸序列没有，也没有建立检测方法。2.螺原体：螺原体（Spiroplasma）是形态类似于螺旋体的细胞内寄生物，可通过0.2μm细菌滤膜。有报道表明螺原体可人工感染河蟹复制出颤抖症状[69]，但不同地区河蟹颤抖病病样中，许多不能检出或分离到螺原体。正是基于这些研究报道，我国《一、二、三类水生动物疫病病种名录释义》中有关河蟹颤抖病的病原结论为： 病原不清。2012年一种新的中华绒螯蟹呼肠孤病毒（EsRV）从中华绒螯蟹患颤抖病体中分离出来[10]， 并证明能造成高死亡率，已获得的结果：（1）已获得EsRV的nearfull length genome，序列分析及gene长度模式，与几个蟹类致病病毒（如SsRV、CsRV）为一个属，而与已报道的河蟹病毒（EsRV905、EsRV816）相隔很远,用EsRV905、EsRV816感染河蟹，河蟹不发生颤抖病症状，且致死率很低；同时病毒基因电泳特征显示与陈辉等及贡成良等报道呼肠孤样病毒也不一样[10]；（2）人工感染显示EsRV具有很高的致死率，导致健康河蟹出现反应迟钝、摄食下降、附肢易脱落、环爪等病症并最终死亡；（3）PCR显示环爪病发病池塘EsRV检出率非常高（80%以上）；而在非发病池塘，一次PCR检出率为0，但二次PCR也有一定比率的检出率（1530%），证明目前养殖河蟹中EsRV已有普遍的感染。相反，其他几个病毒基本未能检测（有序列的病毒EsRV816、905）。而且也没有检测出螺原体感染。
材料与方法
2.1 提取病毒
将患颤抖病的中华绒螯蟹病蟹的内脏(胃,肠,肝胰脏,鳃)加等体积的生理盐水在组织匀浆器中匀浆,分析滤纸过滤,经30000 r.p.m离心30分,沉淀用生理盐水重悬,细菌过滤器(孔径0.22微米)过滤后(取数滴于肉汤培养基中28℃培养进行无菌检验)加双抗处理备用。然后进行人工感染实验，并设置对照组，对照组为健康的中华绒螯蟹，实验组和对照组各有20只，实验组的具体操作为：健康蟹第三步足的第一关节将上述无菌滤过病蟹组织悬液0.1毫升注射进体腔中。实验组和对照组的养殖条件均一致，一段时间后，对照组螃蟹无死亡，也无颤抖病症状，实验组螃蟹有明显的颤抖病症状，收集死蟹，通过电镜观测在蟹组织的细胞质内发现了呼肠孤病毒，将该病毒提纯并测序分析是我们发现的呼肠孤病毒，所以该呼肠孤病毒是中华绒螯蟹颤抖病的病原之一，甚至是主要病原。
2.2 样本采集
样本都选自中国江苏省渔场的健康中华绒螯蟹，将纯化呼肠孤病毒（50微升），腹腔注射于健康蟹（N =10）的步足基部。对照组（n =10）注入生理盐水（50微升）。人工感染螃蟹置于水族箱中培养，喂养和正常管理。水族箱中的水条件溶解氧>5毫克/升，pH值?7.2，温度28±1℃。对受感染螃蟹的病灶进行连续观察，收集所有死蟹并储存在80℃直至使用死蟹。
2.3 RNA提取
取病蟹病变组织提取物反复冻融（80℃，常温）4次后离心（4000r/min,20000r/min）,用TRIZOL试剂(TaKaRa Bio, Dalian, China)通过病毒组织说明书提取病蟹的RNA，并储存在80℃直至使用。
2.4 引物设计
根据已发表的呼肠孤病毒S1的序列设计引物(NCBI GenBank Accession number: KP638413.1)，通过 Primer Explorer V3引物设计软件，包括内引物（FIP和BIP）和外引物对（F3和B3）。同时也设计PCR引物对：EsRVF，EsRVR。以用于PCR的灵敏度和特异性的检测。所有引物序列参见表1。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
2．1 提取病毒 2
2．2 样本选取 2
2．3 RNA提取 2
2. 4 引物设计 3
2. 5 RTLAMP法检测与常规RTPCR检测 3
2. 6 RTLAMP检测法对EsRV的特异性和灵敏度 3
2. 7 临床检测 4
3 结果与分析 5
3．1 优化EsRV RTLAMP检测法 5
3．2 RTLAMP和RTPCR灵敏度检测 6
3．3 凝胶电泳检测RTLAMP的特异性 6
3．4 RTLAMP和RTPCR的适用性 6
4 讨论 7
致谢 7
参考文献 7
新型中华绒螯蟹呼肠弧病毒RTLAMP检测法的建立
引言
河蟹，学名中华绒绒螯蟹(Eriocheir sinensis）是我国养殖产量最大的淡水蟹类，二十世纪九十年代以来，养殖面积逐年增长，遍及江苏、浙江、湖北、 河北、安徽等主要淡水养殖省[1]。河蟹颤抖病 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
（tremor disease，TD），又称河蟹抖抖病、河蟹环爪病，为我国水生动物三类疫病[2]。该病于1994年在江苏省发现，随后传播至安徽、浙江、湖北等主要中华绒螯蟹养殖地[1]。病蟹的主要症状表现为步足出现明显的颤抖现象,指节变红并伴有肝部糜烂、鳃丝略黑、三角膜水肿等特征。此病一般多发生在高温季节7～9月份,并以8月份最为严重[3]。严重发病地区发病率>90%，死亡率>70%，对河蟹养殖业危害巨大。河蟹颤抖病出现已超过二十年，但有关河蟹颤抖病病原的研究一直没有权威的结论。主流报道病原有病毒和螺原体。1.病毒：报道较多的有呼肠孤样病毒（Reolike virus ），主要有呼肠孤病毒EsRV816、EsRV905[4]。这两株病毒已有部分序列，因此可以检测。报道的这两株河蟹呼肠孤病毒对河蟹的致病力低且感染后不出现河蟹颤抖病症状。另有陈辉等及贡成良等[3]也报道了呼肠孤样病毒（不同于EsRV816及EsRV905），但无序列信息；另外，还报道过河蟹小RNA病毒样病毒颗粒[5]和布尼亚样病毒（Bynyalike virus ）。非常遗憾的是有关这些病毒仅有一些很初步的研究，相关核酸序列没有，也没有建立检测方法。2.螺原体：螺原体（Spiroplasma）是形态类似于螺旋体的细胞内寄生物，可通过0.2μm细菌滤膜。有报道表明螺原体可人工感染河蟹复制出颤抖症状[69]，但不同地区河蟹颤抖病病样中，许多不能检出或分离到螺原体。正是基于这些研究报道，我国《一、二、三类水生动物疫病病种名录释义》中有关河蟹颤抖病的病原结论为： 病原不清。2012年一种新的中华绒螯蟹呼肠孤病毒（EsRV）从中华绒螯蟹患颤抖病体中分离出来[10]， 并证明能造成高死亡率，已获得的结果：（1）已获得EsRV的nearfull length genome，序列分析及gene长度模式，与几个蟹类致病病毒（如SsRV、CsRV）为一个属，而与已报道的河蟹病毒（EsRV905、EsRV816）相隔很远,用EsRV905、EsRV816感染河蟹，河蟹不发生颤抖病症状，且致死率很低；同时病毒基因电泳特征显示与陈辉等及贡成良等报道呼肠孤样病毒也不一样[10]；（2）人工感染显示EsRV具有很高的致死率，导致健康河蟹出现反应迟钝、摄食下降、附肢易脱落、环爪等病症并最终死亡；（3）PCR显示环爪病发病池塘EsRV检出率非常高（80%以上）；而在非发病池塘，一次PCR检出率为0，但二次PCR也有一定比率的检出率（1530%），证明目前养殖河蟹中EsRV已有普遍的感染。相反，其他几个病毒基本未能检测（有序列的病毒EsRV816、905）。而且也没有检测出螺原体感染。
材料与方法
2.1 提取病毒
将患颤抖病的中华绒螯蟹病蟹的内脏(胃,肠,肝胰脏,鳃)加等体积的生理盐水在组织匀浆器中匀浆,分析滤纸过滤,经30000 r.p.m离心30分,沉淀用生理盐水重悬,细菌过滤器(孔径0.22微米)过滤后(取数滴于肉汤培养基中28℃培养进行无菌检验)加双抗处理备用。然后进行人工感染实验，并设置对照组，对照组为健康的中华绒螯蟹，实验组和对照组各有20只，实验组的具体操作为：健康蟹第三步足的第一关节将上述无菌滤过病蟹组织悬液0.1毫升注射进体腔中。实验组和对照组的养殖条件均一致，一段时间后，对照组螃蟹无死亡，也无颤抖病症状，实验组螃蟹有明显的颤抖病症状，收集死蟹，通过电镜观测在蟹组织的细胞质内发现了呼肠孤病毒，将该病毒提纯并测序分析是我们发现的呼肠孤病毒，所以该呼肠孤病毒是中华绒螯蟹颤抖病的病原之一，甚至是主要病原。
2.2 样本采集
样本都选自中国江苏省渔场的健康中华绒螯蟹，将纯化呼肠孤病毒（50微升），腹腔注射于健康蟹（N =10）的步足基部。对照组（n =10）注入生理盐水（50微升）。人工感染螃蟹置于水族箱中培养，喂养和正常管理。水族箱中的水条件溶解氧>5毫克/升，pH值?7.2，温度28±1℃。对受感染螃蟹的病灶进行连续观察，收集所有死蟹并储存在80℃直至使用死蟹。
2.3 RNA提取
取病蟹病变组织提取物反复冻融（80℃，常温）4次后离心（4000r/min,20000r/min）,用TRIZOL试剂(TaKaRa Bio, Dalian, China)通过病毒组织说明书提取病蟹的RNA，并储存在80℃直至使用。
2.4 引物设计
根据已发表的呼肠孤病毒S1的序列设计引物(NCBI GenBank Accession number: KP638413.1)，通过 Primer Explorer V3引物设计软件，包括内引物（FIP和BIP）和外引物对（F3和B3）。同时也设计PCR引物对：EsRVF，EsRVR。以用于PCR的灵敏度和特异性的检测。所有引物序列参见表1。
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