克氏原螯虾卵黄蛋白原基因克隆及在性腺不同发育时期的表达分析
卵黄蛋白原作为卵黄蛋白的前体，可为甲壳动物胚胎和早期幼体发育提供能量和营养物质。实验通过 RT-PCR、RACE等技术克隆得到克氏原螯虾卵黄蛋白原的 cDNA 序列全长，其长度为8322bp，软件分析后知其含有一个8154bp 的开放阅读框，其 5和 3的非翻译区分别为 40 bp 和 128bp，预测该序列编码一个含 2717个氨基酸残基的蛋白质。应用实时荧光定量 PCR法检测了克氏原螯虾卵巢不同发育时期卵巢和肝胰腺两种组织中卵黄蛋白原基因的表达。结果显示，克氏原螯虾卵黄蛋白原基因在肝胰腺和卵巢中都有表达，但在肝胰腺中相对表达水平比卵巢中高一个数量级；随着卵巢的发育，克氏原螯虾卵黄蛋白原基因在肝胰腺和卵巢中的表达量逐渐升高，其中在肝胰腺中卵黄蛋白原基因的表达水平在卵巢发育四期达到最高，而在卵巢中是卵巢发育五期才达到最高，显示卵黄蛋白原基因在肝胰腺和卵巢中的表达不是完全同步的。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 克氏原螯虾2
1.1.2 试剂2
1.2 方法 2
1.2.1 总 RNA 的提取2
1.2.2 引物设计2
1.2.3 SMARTRACE 方法克隆目的基因全长3
1.2.4 PCR的产物用于基因测序3
1.2.5 利用生物信息学软件对目的基因进行系统进化分析3
1.2.6 卵黄蛋白原基因在卵巢和肝胰腺中各个不同时期的表达3
2 结果与分析3
2.1 Pc.Vg基因全长 cDNA 序列分析3
2.2卵黄蛋白原进化树构建4
2.3 结构域预测4
2.4 Pc.Vg基因在卵巢不同发育时期的表达5
3 讨论 6
3.1 卵黄蛋白原基因 cDNA 序列的分析6
3.2 卵黄蛋白原在卵巢不同发育阶段的表达分析6
致谢6
参考文献7
克氏原螯虾卵黄蛋白原基因克隆及在性腺不同发育时期的表达分析
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
/> 引言
卵黄蛋白(Vitellin,Vn)是几乎所有非哺乳类卵生动物成熟卵母细胞的主要成分，它能为胚胎及幼体的发育提供氨基酸、脂质、碳水化合物、维生素、硫、磷等营养和功能性物质，促进卵母细胞的生长分化，是胚胎及幼体发育过程中主要的营养来源[1,2,3]。卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)是特异性地存在于非哺乳类卵生动物成熟雌性个体中的一种蛋白，是卵黄蛋白的前体[4]。Vg能结合Ca2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+等金属离子，对于卵巢组织内部金属离子的积累具有重要的作用[5]。Vg是由一个基因家族编码的，对卵黄蛋白原的基因结构进行研究比较，有助于对虾蟹类卵巢发育机制研究，阐明克氏原螯虾的卵黄蛋白原来源及合成过程，进而为人工繁殖的生产实践提供基础的理论依据，真正达到人工干预亲本繁殖与成熟的目的。
克氏原螯虾( Procambarus clarkii)，又称红色沼泽螯虾、小龙虾或克氏螯虾，原产于墨西哥北部和美国南部，在动物分类学上隶属甲壳纲，十足目，螯虾科，原螯虾属。由于该虾适应性广，生命力和繁殖能力强，对水质要求不高，最近十几年，种群发展特别快，在有的湖泊和地区已成为优势种群，已成为我国淡水虾类中的一种重要资源[6]。克氏原螯虾味道鲜美，蛋白质含量高，脂肪含量低，虾黄具有蟹黄味，尤其钙、磷、铁质含量丰富，是营养价值较高的动物性食品，深受市民喜爱。
有关虾蟹类Vg的研究最早可追溯到20世纪60年代，由Horn 等[7]在雌性蓝蟹Callinectes sapidus体内首次观察到Vn和Vg蛋白。到目前为止，国内外已经先后报道了10 余种甲壳动物的Vg分子结构，部分已获得纯化的重组蛋白[5]。Tsutsui 等[8]第一次克隆并报道了日本囊对虾的卵黄蛋白原的全长cDNA 序列，开放阅读框可编码2587个氨基酸残基。到目前为止，已经在GenBank数据库中登录的Vg核苷酸序列有5300余条，其中，甲壳动物的Vg序列有83条，包括十足目的核苷酸序列35条；在已报道的十足目中，具备完整的Vg 核苷酸序列及氨基酸序列信息有16条.现已被研究的甲壳动物Vg 合成部位主要集中在肝胰腺[9]、卵巢[10]。肝胰腺被认为是甲壳类动物卵巢外最主要的Vg 合成部位[9]。虾蟹类中有关卵母细胞自身合成Vg 的报道相对比较少，一般可归纳为两种主要方式：Vg 在肝胰腺和卵巢中表达；Vg 仅在肝胰腺中表达[11]。
本试验采用RACE 技术克隆克氏原螯虾的卵黄蛋白原基因的全长 cDNA 序列，实时定量 PCR 技术检测该基因在卵巢发育的5个不同时期，卵巢和肝胰脏内的卵黄蛋白原 mRNA 的相对表达水平，证明卵黄蛋白原基因对克氏原螯虾生殖细胞的生长和发育可能具有重要作用，为甲壳动物性腺发育调控的分子机制奠定基础。力求在克氏原螯虾的生产上，实现人工干预亲本繁殖与成熟，获取最大的经济效益。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 克氏原螯虾 2013年6月至2013年10月从无锡农贸市场购买不同发育阶段的克氏原螯虾，卵巢发育阶段通过其外部形态，颜色，及组织学特性可分为6个时期：卵巢发育初期(I期)呈白色透明状，未见卵粒；II期和III期卵巢中的卵粒颜色逐步变黄加深；发育至IVV期，卵黄沉积后的卵粒呈深褐色；产卵后的卵巢(VI期)呈空管状，残存有少量未成熟的卵子[12]。取克氏原螯虾I到V期的卵巢和肝胰脏各0.20.4g，将其立即放入液氮中,储藏于80℃中备用。
1．1．2 试剂 Total RNA提取试剂盒、3RACE和5RACE试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、pEASYT1载体、大肠杆菌感受态细胞、质粒提取试剂盒、基因特异性引物
1．1．3 仪器 荧光定量PCR仪、离心机、低温离心机、暗箱式紫外分析仪、PCR扩增仪、电泳仪、无菌操作台、生化培养箱、恒温培养摇床、水浴锅和电子天平等常规仪器。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 克氏原螯虾2
1.1.2 试剂2
1.2 方法 2
1.2.1 总 RNA 的提取2
1.2.2 引物设计2
1.2.3 SMARTRACE 方法克隆目的基因全长3
1.2.4 PCR的产物用于基因测序3
1.2.5 利用生物信息学软件对目的基因进行系统进化分析3
1.2.6 卵黄蛋白原基因在卵巢和肝胰腺中各个不同时期的表达3
2 结果与分析3
2.1 Pc.Vg基因全长 cDNA 序列分析3
2.2卵黄蛋白原进化树构建4
2.3 结构域预测4
2.4 Pc.Vg基因在卵巢不同发育时期的表达5
3 讨论 6
3.1 卵黄蛋白原基因 cDNA 序列的分析6
3.2 卵黄蛋白原在卵巢不同发育阶段的表达分析6
致谢6
参考文献7
克氏原螯虾卵黄蛋白原基因克隆及在性腺不同发育时期的表达分析
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
/> 引言
卵黄蛋白(Vitellin,Vn)是几乎所有非哺乳类卵生动物成熟卵母细胞的主要成分，它能为胚胎及幼体的发育提供氨基酸、脂质、碳水化合物、维生素、硫、磷等营养和功能性物质，促进卵母细胞的生长分化，是胚胎及幼体发育过程中主要的营养来源[1,2,3]。卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)是特异性地存在于非哺乳类卵生动物成熟雌性个体中的一种蛋白，是卵黄蛋白的前体[4]。Vg能结合Ca2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+等金属离子，对于卵巢组织内部金属离子的积累具有重要的作用[5]。Vg是由一个基因家族编码的，对卵黄蛋白原的基因结构进行研究比较，有助于对虾蟹类卵巢发育机制研究，阐明克氏原螯虾的卵黄蛋白原来源及合成过程，进而为人工繁殖的生产实践提供基础的理论依据，真正达到人工干预亲本繁殖与成熟的目的。
克氏原螯虾( Procambarus clarkii)，又称红色沼泽螯虾、小龙虾或克氏螯虾，原产于墨西哥北部和美国南部，在动物分类学上隶属甲壳纲，十足目，螯虾科，原螯虾属。由于该虾适应性广，生命力和繁殖能力强，对水质要求不高，最近十几年，种群发展特别快，在有的湖泊和地区已成为优势种群，已成为我国淡水虾类中的一种重要资源[6]。克氏原螯虾味道鲜美，蛋白质含量高，脂肪含量低，虾黄具有蟹黄味，尤其钙、磷、铁质含量丰富，是营养价值较高的动物性食品，深受市民喜爱。
有关虾蟹类Vg的研究最早可追溯到20世纪60年代，由Horn 等[7]在雌性蓝蟹Callinectes sapidus体内首次观察到Vn和Vg蛋白。到目前为止，国内外已经先后报道了10 余种甲壳动物的Vg分子结构，部分已获得纯化的重组蛋白[5]。Tsutsui 等[8]第一次克隆并报道了日本囊对虾的卵黄蛋白原的全长cDNA 序列，开放阅读框可编码2587个氨基酸残基。到目前为止，已经在GenBank数据库中登录的Vg核苷酸序列有5300余条，其中，甲壳动物的Vg序列有83条，包括十足目的核苷酸序列35条；在已报道的十足目中，具备完整的Vg 核苷酸序列及氨基酸序列信息有16条.现已被研究的甲壳动物Vg 合成部位主要集中在肝胰腺[9]、卵巢[10]。肝胰腺被认为是甲壳类动物卵巢外最主要的Vg 合成部位[9]。虾蟹类中有关卵母细胞自身合成Vg 的报道相对比较少，一般可归纳为两种主要方式：Vg 在肝胰腺和卵巢中表达；Vg 仅在肝胰腺中表达[11]。
本试验采用RACE 技术克隆克氏原螯虾的卵黄蛋白原基因的全长 cDNA 序列，实时定量 PCR 技术检测该基因在卵巢发育的5个不同时期，卵巢和肝胰脏内的卵黄蛋白原 mRNA 的相对表达水平，证明卵黄蛋白原基因对克氏原螯虾生殖细胞的生长和发育可能具有重要作用，为甲壳动物性腺发育调控的分子机制奠定基础。力求在克氏原螯虾的生产上，实现人工干预亲本繁殖与成熟，获取最大的经济效益。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 克氏原螯虾 2013年6月至2013年10月从无锡农贸市场购买不同发育阶段的克氏原螯虾，卵巢发育阶段通过其外部形态，颜色，及组织学特性可分为6个时期：卵巢发育初期(I期)呈白色透明状，未见卵粒；II期和III期卵巢中的卵粒颜色逐步变黄加深；发育至IVV期，卵黄沉积后的卵粒呈深褐色；产卵后的卵巢(VI期)呈空管状，残存有少量未成熟的卵子[12]。取克氏原螯虾I到V期的卵巢和肝胰脏各0.20.4g，将其立即放入液氮中,储藏于80℃中备用。
1．1．2 试剂 Total RNA提取试剂盒、3RACE和5RACE试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、pEASYT1载体、大肠杆菌感受态细胞、质粒提取试剂盒、基因特异性引物
1．1．3 仪器 荧光定量PCR仪、离心机、低温离心机、暗箱式紫外分析仪、PCR扩增仪、电泳仪、无菌操作台、生化培养箱、恒温培养摇床、水浴锅和电子天平等常规仪器。
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