微丝标记探针遗传转化蒺藜苜蓿的研究
微丝骨架是细胞骨架的重要成员之一,通过其动态的聚合和解聚参与许多植物生命过程，包括花粉管和根毛的极性生长、自交不亲和反应、根瘤菌侵染过程中根毛的变形等。本研究拟通过建立高效的蒺藜苜蓿遗传转化体系，将微丝骨架标记探针lifeact-mGFP导入蒺藜苜蓿中，获得共培养转基因植株。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法5
1.1实验材料 5
1.1.1植物材料 5
1.1.2载体 5
1.1.3菌株 5
1.2试剂与仪器 5
1.2.1常用培养基的配制5
1.2.2常用试剂及溶液配制6
1.2.3仪器设备6
1.3实验方法 7
1.3.1普通pcr 7
1.3.2 pcr回收 7
1.3.3目的基因连接7
1.3.4大肠杆菌的转化 7
1.3.5质粒转化农杆菌 7
1.3.6蒺藜苜蓿植株材料的处理 8
1.3.7农杆菌侵染 8
2结果与分析9
2.1构建了LifeacteGFP载体9
2.2获得了LifeacteGFP转基因蒺藜苜蓿10
2.3对转基因蒺藜苜蓿的分子检测11
3讨论 12
3.1构建了LifeacteGFP载体12
3.2可能影响发根农杆菌遗传转化效率的因素12
3.2.1外植体的培养与选择12
3.2.2 共培养时间 12
3.2.3 体胚培养的环境温度 12
3.2.4 无菌环境的控制 12
致谢13
参考文献13
微丝骨架标记探针遗传转化蒺藜苜蓿的研究
引言
引言
研究进展
1.微丝骨架及微丝骨架标记探针
细胞骨架(cytoskeleton)是穿越细胞质的纤维状蛋白质多聚体,其组成部分包括有微丝(microfilament, M *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
F)、中间纤维 (intermediate filament)、微管 (microtubule, MT)。微丝又被称为肌动蛋白纤维(actin filament, Factin),是植物、动物和真核微生物中高度保守、普遍存在的聚合物。
细胞中存在着两种形式的肌动蛋白,一种形式是是球状，其被称为单体肌动蛋白 (Gactin),而另外一种的形式则是是纤维状的，其被称为肌动蛋白多聚体(Factin)。微丝骨架通过在Gactin和Factin之间变化维持自身的平衡同时响应胞外信号刺激,导致微丝骨架的动态变化 [1]。Gactin分子量为42 kDa,具有极性,由两个球形结构域组成,两个结构域中间有个裂缝,有核苷酸(ATP 或ADP) 和二价阳离子(Ca2+或Mg2+)结合位点。在ATP,Mg2+等合适的条件下,Gactin聚合成直径约7 nm,螺距为36 nm的双股螺旋丝状纤维结构,即Factin [2]。Gactin 单体具有很强的极性,所以由该单体形成的微丝也是有极性的。微丝的装配过可以被详细的分为以下四个阶段:分别是Gactin单体的活化, 成核 (nucleation) 阶段, 延伸过程 (elongation)和稳态阶段(steady state)。首先Mg2+取代Ca2+和Gactin 结合,Gactin构象发生改变,Gactin变成激活状态。若干个与腺嘌呤三核苷酸(ATP)结合的Gactin 聚合为一个寡聚体 (oligomers) 称为成核阶段,成核阶段速度通常比较慢。在延伸阶段,GactinATP 不断结合到微丝核的两端,GactinATP在两端的添加速度不同,生长快的末端称作正端 (barbed end),生长慢的为负端 (pointed end)。微丝两端的Gactin 可以与ATP 结合,但中间Gactin上的ATP 则会水解成腺嘌呤二核苷酸 (ADP)。当微丝延伸到一定阶段,Gactin添加到微丝的同时,也会有Gactin从微丝上解离下来。微丝负端的生长所需要游离的Gactin的浓度比正端生长所需Gactin的浓度大。如果Gactin的浓度正好处于微丝正端生长而负端解离时,微丝的长度不再延伸,达到动态稳定阶段 [3],上述的动态过程，被称为踏车现象 (treadmilling)。踏车模型是微丝组装过程的理想状态。
但在细胞中,微丝列阵的组织结构、维持以及周转都与踏车模型有所出入,Stagie等人又提出新的随机动态组装模型来解释微丝骨架动态变化的过程随机动态组装模型认为大部分的微丝都是以微丝单体库的形式存在。新的微丝可以在细胞质中从头合成或者从已经存在的微丝侧边形成。其余微丝也可以从微丝片段或者已被切割的微丝末端进行生长。微丝生长速率和单体微丝库的大小以及成核因子有关。而微丝分解速率主要受微丝切割以及随后的加帽作用调控,不由微丝负端的解聚过程所影响。同时微丝单体从微丝片段上解离下来后又可以进入微丝单体库中。
微丝骨架这一结构，在真核细胞的许多生理生化功能方面，起着至关重要的作用。所以观察活细胞中的微丝骨架是研究这些重要现象的有力方法学,而微丝探针就成为了媒介,近来已发展了一些有用的微丝探针。为观察活细胞微丝建立的荧光探针,特别是绿色荧光蛋白 (GFP),大大方便了我们对微丝动态的了解。起初actinGFP 融合蛋白被成功地用于观察微丝,然而微丝的直接标记削弱了本身的功能 [4],还会削弱微丝的清晰度。后来出现了GFP 标记的微丝侧翼结合蛋白,即GFP 融合在小鼠踝蛋白的微丝结合结构域或拟南芥fimbrin1的微丝结合结构域 (ABD2)上。现在主要使用这两个探针来观察植物细胞中的微丝,使研究者们能识别与植物不同功能相伴随的微丝的不同结构和动态变化[5]。但是这两个探针也被报道对微丝的组织或依赖于肌球蛋白的细胞器运动具有负面影响。这就需要建立一个具有不同分子特征的新的微丝探针。近来报道,酵母蛋白Abp140的前17个氨基酸与GFP 融合后就足以用来定位微丝,这段多肽称为“Lifeact”,由于它与微丝的低亲和力在体外不影响微丝的聚合或解聚,在体内与微丝结合蛋白不会竞争微丝。此外,它与胞内蛋白的竞争可能性也很小,从而能很好的标记微丝。利用Lifeact已经观察了拟南芥根毛细胞里微丝网络的重排过程和地钱细胞里的微丝运动,而且用LifeactmEGFP 能够标记苔藓多种细胞类型中的微丝。所以现在认为Lifeact是一个多功能的微丝标记分子,甚至能替代鬼笔环肽。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法5
1.1实验材料 5
1.1.1植物材料 5
1.1.2载体 5
1.1.3菌株 5
1.2试剂与仪器 5
1.2.1常用培养基的配制5
1.2.2常用试剂及溶液配制6
1.2.3仪器设备6
1.3实验方法 7
1.3.1普通pcr 7
1.3.2 pcr回收 7
1.3.3目的基因连接7
1.3.4大肠杆菌的转化 7
1.3.5质粒转化农杆菌 7
1.3.6蒺藜苜蓿植株材料的处理 8
1.3.7农杆菌侵染 8
2结果与分析9
2.1构建了LifeacteGFP载体9
2.2获得了LifeacteGFP转基因蒺藜苜蓿10
2.3对转基因蒺藜苜蓿的分子检测11
3讨论 12
3.1构建了LifeacteGFP载体12
3.2可能影响发根农杆菌遗传转化效率的因素12
3.2.1外植体的培养与选择12
3.2.2 共培养时间 12
3.2.3 体胚培养的环境温度 12
3.2.4 无菌环境的控制 12
致谢13
参考文献13
微丝骨架标记探针遗传转化蒺藜苜蓿的研究
引言
引言
研究进展
1.微丝骨架及微丝骨架标记探针
细胞骨架(cytoskeleton)是穿越细胞质的纤维状蛋白质多聚体,其组成部分包括有微丝(microfilament, M *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
F)、中间纤维 (intermediate filament)、微管 (microtubule, MT)。微丝又被称为肌动蛋白纤维(actin filament, Factin),是植物、动物和真核微生物中高度保守、普遍存在的聚合物。
细胞中存在着两种形式的肌动蛋白,一种形式是是球状，其被称为单体肌动蛋白 (Gactin),而另外一种的形式则是是纤维状的，其被称为肌动蛋白多聚体(Factin)。微丝骨架通过在Gactin和Factin之间变化维持自身的平衡同时响应胞外信号刺激,导致微丝骨架的动态变化 [1]。Gactin分子量为42 kDa,具有极性,由两个球形结构域组成,两个结构域中间有个裂缝,有核苷酸(ATP 或ADP) 和二价阳离子(Ca2+或Mg2+)结合位点。在ATP,Mg2+等合适的条件下,Gactin聚合成直径约7 nm,螺距为36 nm的双股螺旋丝状纤维结构,即Factin [2]。Gactin 单体具有很强的极性,所以由该单体形成的微丝也是有极性的。微丝的装配过可以被详细的分为以下四个阶段:分别是Gactin单体的活化, 成核 (nucleation) 阶段, 延伸过程 (elongation)和稳态阶段(steady state)。首先Mg2+取代Ca2+和Gactin 结合,Gactin构象发生改变,Gactin变成激活状态。若干个与腺嘌呤三核苷酸(ATP)结合的Gactin 聚合为一个寡聚体 (oligomers) 称为成核阶段,成核阶段速度通常比较慢。在延伸阶段,GactinATP 不断结合到微丝核的两端,GactinATP在两端的添加速度不同,生长快的末端称作正端 (barbed end),生长慢的为负端 (pointed end)。微丝两端的Gactin 可以与ATP 结合,但中间Gactin上的ATP 则会水解成腺嘌呤二核苷酸 (ADP)。当微丝延伸到一定阶段,Gactin添加到微丝的同时,也会有Gactin从微丝上解离下来。微丝负端的生长所需要游离的Gactin的浓度比正端生长所需Gactin的浓度大。如果Gactin的浓度正好处于微丝正端生长而负端解离时,微丝的长度不再延伸,达到动态稳定阶段 [3],上述的动态过程，被称为踏车现象 (treadmilling)。踏车模型是微丝组装过程的理想状态。
但在细胞中,微丝列阵的组织结构、维持以及周转都与踏车模型有所出入,Stagie等人又提出新的随机动态组装模型来解释微丝骨架动态变化的过程随机动态组装模型认为大部分的微丝都是以微丝单体库的形式存在。新的微丝可以在细胞质中从头合成或者从已经存在的微丝侧边形成。其余微丝也可以从微丝片段或者已被切割的微丝末端进行生长。微丝生长速率和单体微丝库的大小以及成核因子有关。而微丝分解速率主要受微丝切割以及随后的加帽作用调控,不由微丝负端的解聚过程所影响。同时微丝单体从微丝片段上解离下来后又可以进入微丝单体库中。
微丝骨架这一结构，在真核细胞的许多生理生化功能方面，起着至关重要的作用。所以观察活细胞中的微丝骨架是研究这些重要现象的有力方法学,而微丝探针就成为了媒介,近来已发展了一些有用的微丝探针。为观察活细胞微丝建立的荧光探针,特别是绿色荧光蛋白 (GFP),大大方便了我们对微丝动态的了解。起初actinGFP 融合蛋白被成功地用于观察微丝,然而微丝的直接标记削弱了本身的功能 [4],还会削弱微丝的清晰度。后来出现了GFP 标记的微丝侧翼结合蛋白,即GFP 融合在小鼠踝蛋白的微丝结合结构域或拟南芥fimbrin1的微丝结合结构域 (ABD2)上。现在主要使用这两个探针来观察植物细胞中的微丝,使研究者们能识别与植物不同功能相伴随的微丝的不同结构和动态变化[5]。但是这两个探针也被报道对微丝的组织或依赖于肌球蛋白的细胞器运动具有负面影响。这就需要建立一个具有不同分子特征的新的微丝探针。近来报道,酵母蛋白Abp140的前17个氨基酸与GFP 融合后就足以用来定位微丝,这段多肽称为“Lifeact”,由于它与微丝的低亲和力在体外不影响微丝的聚合或解聚,在体内与微丝结合蛋白不会竞争微丝。此外,它与胞内蛋白的竞争可能性也很小,从而能很好的标记微丝。利用Lifeact已经观察了拟南芥根毛细胞里微丝网络的重排过程和地钱细胞里的微丝运动,而且用LifeactmEGFP 能够标记苔藓多种细胞类型中的微丝。所以现在认为Lifeact是一个多功能的微丝标记分子,甚至能替代鬼笔环肽。
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