popw蛋白防治番茄细菌性疮痂病的机理研究
摘要：前期研究发现，激发子蛋白PopW具有广谱的防病功能，可用于植物病原真菌、卵菌、病毒、细菌引起的病害的防治。本项目研究中，利用50 mg/L PopW蛋白喷雾处理番茄叶片5 d后接种病原菌Xanthomonas euvesicatoria（X. e.），发现处理4 d后X. e.的定殖能力相对单独接种X. e.显著降低。PopW处理显著提高了植物叶片中活性氧的爆发和胼胝质的淀积，对番茄疮痂病的防治效果可达50%以上。研究结果显示，PopW蛋白在抵抗X. e.侵染过程中，在植物细胞水平诱导了植物抗病性的产生。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法 2
1.1 植物与菌剂的培养2
1.2 PopW蛋白对番茄疮痂病生防效果2
1.3 病原菌的定殖能力检测2
1.4 不同生防菌对X. e.的拮抗作用3
1.4.1活性氧的检测 3
1.4.2 胼胝质的染色3
1.5 数据统计分析 3
2 结果与分析 3
2.1不同浓度PopW蛋白的生防效果3
2.2 PopW蛋白抑制X. e.的定殖5
2.3不同生防菌株对细菌X. e.的拮抗作用 5
2.4 PopW蛋白诱导番茄叶片活性氧的爆发6
2.5 PopW蛋白提高植物胼胝质的积累6
3 讨论7
致谢8
参考文献8
PopW蛋白防治番茄细菌性疮痂病的机理研究
引言
引言：番茄是全球性的“菜篮子”蔬菜，同时也是市场上每日可见的一种水果。番茄细菌性疮痂病，由Xanthomonas euvesicatoria（X. e.）引起，是目前我国，尤其是新疆、山东、山西等地普遍发生的一种病害，通常可造成20% 43%的产量损失，当昼夜温度高且湿度大时，可造成60%以上减产甚至绝产，严重影响了番茄的产量和品质[1][2]，目前尚未找到合适的防治方法。
Harpin蛋白是指来源于革兰氏阴性病原细菌的一类由hrp基
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
因编码的水溶性蛋白，其具有典型结构和生物学特征：富含甘氨酸（Gly）、不含半胱氨酸（Cys），热稳定，对蛋白质酶敏感，能在非寄主植物烟草上引起过敏性反应[3][4]。PopW作为一个新鉴定出的Harpin蛋白，其来源于R. solanacearum ZJ3721，发现其对多种作物多种病害，例如Fulvia fulva 引起的番茄叶霉病，Tobacco mosaic virus(TMV)引起的烟草花叶病毒病，Ustilaginoidea virens 引起的水稻稻曲病，Pseudoperonospora cubensis引起的黄瓜霜霉病[5][6]，具有很好的防治作用，是一种广谱的抗病蛋白。研究发现PopW的转基因烟草能对烟草花叶病毒和番茄青枯病具有很好的防效。通过相关的基因转录水平的检测，推测出PopW可能参与SA信号通路，诱导植物抗病性[5]，表明PopW作为获得性抗性诱导子在生物防治中起到重要作用。
1 材料与方法
植物与菌剂培养
番茄品种为“合作903”。将番茄种子进行表面消毒（70%无水乙醇表面消毒12 min，0.05%次氯酸钠溶液浸泡10 min，灭菌水润洗5次），播种于育苗盘中后放置于28℃，16/8 h光周期，70%相对湿度以上温室中进行培育。待番茄苗长到34片真叶（15 d左右）时进行移栽。将番茄幼苗移栽入装满基质的一次性塑料杯中（上口外径14.7 cm，上口内径12.8 cm，底径9.3 cm，高11 cm），每杯一株，置于温度28℃，70%相对湿度，光周期为16/8 h的温室中，两周后进行试验。
所用病原菌为利福平（100 μg/mL）抗性的黄单胞菌X. e.（Xanthomonas euvesicatoria）。该病原菌X. e. Rif100保存于70℃冰箱中。使用前在含有100 μg/mL的利福平抗生素的NYGA培养基（NYGA 1 L:蛋白胨10 g；甘油20 g；酵母浸粉3 g；琼脂15 g，调PH为7.07.2之间。分装后121℃灭菌20 min）上划线，28 ℃培养72 h。挑选单菌落转接到含相同浓度的NYGB培养液中28℃ 200 rpm摇1618 h培养（至对数生长期）；将培养好的种子液以1%的接种量转入灭菌的NYGB培养液中进行扩大培养，28℃ 200 rpm培养24 h；所得的菌液于4℃ 6000 rpm离心10 min后收集菌体，菌体用0.85% NaCl重悬至浓度3.0×108 CFU/mL备用。
将含有重组质粒pETpopW的转化子BLPopW接种于5 mL含有50 mg/L Kan的LB液体培养液中，37℃振荡培养过夜；按1%的比例接入含有50 mg/L卡那霉素的新鲜LB 液体培养液中，37℃振荡培养至OD600为0.60.8（大约3 h），加入终浓度为1.0 mM的异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG），37℃继续振荡培养3 h；上述菌液以5000×g，4℃，离心5 min，收集菌体；然后用1/10体积灭菌后的0.85% NaCl重悬菌体，水煮，沸腾10 min以破壁，10000×g，4℃，离心10 min，收集上清液即为初步纯化的可溶性蛋白，稀释备用。浓度检测采用考马斯亮蓝法。
PopW蛋白对番茄疮痂病生防效果
移栽后2周喷雾接种PopW蛋白。将稀释好的PopW蛋白加入终浓度为0.01%的表面活性剂Silwet L77的生防制剂后喷施植物。蛋白处理5 d后喷雾接种病原菌（1× 108 CFU/mL，Silwet L77 0.01%），使所有叶片均匀布满菌液。将番茄植株置于100%湿度的温室中培养24 h，然后将湿度下降到70%。当第一个病斑出现后统计生防效果，直到所有叶片都出现病症为止。出现第一株发病植株时就开始统计发病率（病情统计），病情指数参照。
生防效果统计：
病情指数=[Σ (各级病株数×各级代表值)／调查植株总数×最高一级代表值]×100%；
防效%=(对照病情指数－处理病情指数)／对照病害严重度×100%。
1.3病原菌的定殖能力检测
将浓度为50 mg/L的PopW蛋白，0.01% Silwet L77喷洒在番茄叶片上，5天之后再喷洒X. e.（3× 108 CFU/mL，Silwet L77 at 0.01%）于叶片上。喷雾处理病原菌后0、1、3、4天取番茄叶片1 g，将叶片浸于70﹪乙醇中3040 s，无菌水漂洗23次，自然风干后放于灭菌的研钵内，加入9 mL无菌的0.85% NaCl和0.5 g石英砂/玻璃珠，充分研磨，静置10 min后，取上清液10倍梯度稀释，分别取100 μL涂布于含抗生素的NYGB平板上，置28 ℃培养箱内培养72 h后，计数菌落，计算细菌在组织内的数量（CFU/g）。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法 2
1.1 植物与菌剂的培养2
1.2 PopW蛋白对番茄疮痂病生防效果2
1.3 病原菌的定殖能力检测2
1.4 不同生防菌对X. e.的拮抗作用3
1.4.1活性氧的检测 3
1.4.2 胼胝质的染色3
1.5 数据统计分析 3
2 结果与分析 3
2.1不同浓度PopW蛋白的生防效果3
2.2 PopW蛋白抑制X. e.的定殖5
2.3不同生防菌株对细菌X. e.的拮抗作用 5
2.4 PopW蛋白诱导番茄叶片活性氧的爆发6
2.5 PopW蛋白提高植物胼胝质的积累6
3 讨论7
致谢8
参考文献8
PopW蛋白防治番茄细菌性疮痂病的机理研究
引言
引言：番茄是全球性的“菜篮子”蔬菜，同时也是市场上每日可见的一种水果。番茄细菌性疮痂病，由Xanthomonas euvesicatoria（X. e.）引起，是目前我国，尤其是新疆、山东、山西等地普遍发生的一种病害，通常可造成20% 43%的产量损失，当昼夜温度高且湿度大时，可造成60%以上减产甚至绝产，严重影响了番茄的产量和品质[1][2]，目前尚未找到合适的防治方法。
Harpin蛋白是指来源于革兰氏阴性病原细菌的一类由hrp基
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
因编码的水溶性蛋白，其具有典型结构和生物学特征：富含甘氨酸（Gly）、不含半胱氨酸（Cys），热稳定，对蛋白质酶敏感，能在非寄主植物烟草上引起过敏性反应[3][4]。PopW作为一个新鉴定出的Harpin蛋白，其来源于R. solanacearum ZJ3721，发现其对多种作物多种病害，例如Fulvia fulva 引起的番茄叶霉病，Tobacco mosaic virus(TMV)引起的烟草花叶病毒病，Ustilaginoidea virens 引起的水稻稻曲病，Pseudoperonospora cubensis引起的黄瓜霜霉病[5][6]，具有很好的防治作用，是一种广谱的抗病蛋白。研究发现PopW的转基因烟草能对烟草花叶病毒和番茄青枯病具有很好的防效。通过相关的基因转录水平的检测，推测出PopW可能参与SA信号通路，诱导植物抗病性[5]，表明PopW作为获得性抗性诱导子在生物防治中起到重要作用。
1 材料与方法
植物与菌剂培养
番茄品种为“合作903”。将番茄种子进行表面消毒（70%无水乙醇表面消毒12 min，0.05%次氯酸钠溶液浸泡10 min，灭菌水润洗5次），播种于育苗盘中后放置于28℃，16/8 h光周期，70%相对湿度以上温室中进行培育。待番茄苗长到34片真叶（15 d左右）时进行移栽。将番茄幼苗移栽入装满基质的一次性塑料杯中（上口外径14.7 cm，上口内径12.8 cm，底径9.3 cm，高11 cm），每杯一株，置于温度28℃，70%相对湿度，光周期为16/8 h的温室中，两周后进行试验。
所用病原菌为利福平（100 μg/mL）抗性的黄单胞菌X. e.（Xanthomonas euvesicatoria）。该病原菌X. e. Rif100保存于70℃冰箱中。使用前在含有100 μg/mL的利福平抗生素的NYGA培养基（NYGA 1 L:蛋白胨10 g；甘油20 g；酵母浸粉3 g；琼脂15 g，调PH为7.07.2之间。分装后121℃灭菌20 min）上划线，28 ℃培养72 h。挑选单菌落转接到含相同浓度的NYGB培养液中28℃ 200 rpm摇1618 h培养（至对数生长期）；将培养好的种子液以1%的接种量转入灭菌的NYGB培养液中进行扩大培养，28℃ 200 rpm培养24 h；所得的菌液于4℃ 6000 rpm离心10 min后收集菌体，菌体用0.85% NaCl重悬至浓度3.0×108 CFU/mL备用。
将含有重组质粒pETpopW的转化子BLPopW接种于5 mL含有50 mg/L Kan的LB液体培养液中，37℃振荡培养过夜；按1%的比例接入含有50 mg/L卡那霉素的新鲜LB 液体培养液中，37℃振荡培养至OD600为0.60.8（大约3 h），加入终浓度为1.0 mM的异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG），37℃继续振荡培养3 h；上述菌液以5000×g，4℃，离心5 min，收集菌体；然后用1/10体积灭菌后的0.85% NaCl重悬菌体，水煮，沸腾10 min以破壁，10000×g，4℃，离心10 min，收集上清液即为初步纯化的可溶性蛋白，稀释备用。浓度检测采用考马斯亮蓝法。
PopW蛋白对番茄疮痂病生防效果
移栽后2周喷雾接种PopW蛋白。将稀释好的PopW蛋白加入终浓度为0.01%的表面活性剂Silwet L77的生防制剂后喷施植物。蛋白处理5 d后喷雾接种病原菌（1× 108 CFU/mL，Silwet L77 0.01%），使所有叶片均匀布满菌液。将番茄植株置于100%湿度的温室中培养24 h，然后将湿度下降到70%。当第一个病斑出现后统计生防效果，直到所有叶片都出现病症为止。出现第一株发病植株时就开始统计发病率（病情统计），病情指数参照。
生防效果统计：
病情指数=[Σ (各级病株数×各级代表值)／调查植株总数×最高一级代表值]×100%；
防效%=(对照病情指数－处理病情指数)／对照病害严重度×100%。
1.3病原菌的定殖能力检测
将浓度为50 mg/L的PopW蛋白，0.01% Silwet L77喷洒在番茄叶片上，5天之后再喷洒X. e.（3× 108 CFU/mL，Silwet L77 at 0.01%）于叶片上。喷雾处理病原菌后0、1、3、4天取番茄叶片1 g，将叶片浸于70﹪乙醇中3040 s，无菌水漂洗23次，自然风干后放于灭菌的研钵内，加入9 mL无菌的0.85% NaCl和0.5 g石英砂/玻璃珠，充分研磨，静置10 min后，取上清液10倍梯度稀释，分别取100 μL涂布于含抗生素的NYGB平板上，置28 ℃培养箱内培养72 h后，计数菌落，计算细菌在组织内的数量（CFU/g）。
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