胶状溶杆菌中第二信使cdigmp合成相关基因的克隆及敲除载体的构建
胶状溶杆菌（Lysobacter gummosus）属于黄单胞科(Xanthomonadaceae)，溶杆菌属(Lysobacter)，是一种重要的革兰氏阴性生防细菌，该菌能合成一些结构未知的小分子抗菌物质，抑制多种植物病原真菌的生长。环二鸟苷酸（c-di-GMP）是广泛存在于细菌中的一种第二信使，调控细菌多种重要的生理生化功能。本文以实验室具有自主知识产权的菌株OH17为对象，旨在探索c-di-GMP对胶状溶杆菌抗菌活性的贡献，主要侧重该物质合成相关蛋白（含有GGDEF结构域的蛋白负责c-di-GMP的合成）编码基因的克隆及敲除载体的构建。本文对OH17的全基因组进行分析，从中鉴定了与c-di-GMP代谢相关的蛋白24个，包括12个可能参与c-di-GMP合成的蛋白，即含有GGDEF结构域的蛋白。以这12个蛋白的编码基为对象通过PCR、酶切、连接等分子生物学技术，成功构建了12个敲除载体（用于基因同源双交换），为后续缺失每一个合成基因，研究其生化和调控功能提供了材料支撑。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 菌种和质粒的来源2
1.2培养基和抗生素3
1.2.1培养基3
1.2.2 抗生素及其使用浓度3
1.3培养条件3
1.3.1 胶状溶杆菌OH17的培养与保存3
1.3.2大肠杆菌TOP10培养与保存3
1.4主要试剂3
1.5实验器材3
1．6 实验原理3
1.6.1敲除载体构建策略4
1.6.2同源重组原理4
1.7实验方法4
1.7.1 OH17基因组DNA的提取4
1.7.2引物的设计5
1.7.3 PCR反应体系及程序6
1.7.4琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物6
1.7.5 PCR产物纯化6
1.7.6 PCR扩增产物的凝胶回收7
1.7.7质粒pJQ200SK的提取7
1.7.8同源片段、质粒pJQ200S *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
K酶切8
1.7.9片段及载体的连接8
1.7.10 TOP10热转感受态的制备9
1.7.11连接产物的转化及验证9
1.7.12连接产物的转化及验证9
2 结果与分析9
2.1 从胶状溶杆菌OH17中鉴定了12个与cdiGMP合成相关的基因9
2.2 敲除载体构建及验证10
2.2.1构建获得重组质粒10
3讨论14
致谢 15
参考文献 15
胶状溶杆菌中第二信使cdiGMP合成相关基因的克隆及敲除载体的构建
引言
溶杆菌属于黄单胞科(Xanthomonadaceae)，溶杆菌属(Lysobacter)，是一类环境友好、但较难分离的有益革兰氏阴性细菌（Christensen & Cook, 1978）。这类细菌以产生结构多样的小分子抗菌（真菌、细菌等）物质而闻名，是一类新型抗菌代谢产物的重要来源，但未完全开发的生防细菌[1,2]。截止2014年，国际上报道的溶杆菌属细菌已达到22个种，包括4个典型种，即产酶溶杆菌（L. enzymogenes）、产抗生素溶杆菌（L. antibioticus）、胶状溶杆菌（L. gummosus）和变棕溶杆菌（L.brunescens）。
胶状溶杆菌OH17是本实验室从安徽水稻根际土壤中分离筛选到的一株对丝状真菌、酵母和卵菌均具有拮抗活性的菌株，具有自主知识产权。通过培养性状观察、生理生化测定以及基于16S rDNA的分子生物学研究，将该菌株鉴定为胶状溶杆菌（L. gummosus）。目前，本课题组已经完成了该菌株的基因组测序，并从中鉴定了12个与次生代谢产物相关的基因簇。同时，课题组也建立了OH17的遗传操作体系，实现了基因的定向敲除和互补。利用该操作体系，课题组正在研究这些基因簇的生物学功能期望从中发现与抗菌活性以及小分子抗菌物质的生物合成相关的基因簇。
与此同时，本课题组还期望利用基因遗传调控的手段来获得抗菌活性丧失或显著下降的突变株。通过对野生型OH17和这些突变株代谢产物的化学分析，快速定位与抗菌活性相关的小分子代谢物质，进而研究它们在OH17中的生物合成机理。本人的毕业实习课题就是围绕该总体目标来设计和开展相关实验的。具体来说，本人的研究目标是探索细菌新型第二信使环二鸟苷酸（cdiGMP）在胶状溶杆菌OH17抗菌活性发挥中的功能，主要聚焦OH17中cdiGMP合成相关基因的克隆及敲除载体的构建。
cdiGMP 或cyclic diguanylate 是细菌中新发现的一种第二信使，它于1987年作为Gluconacetobacter xylinus中合成纤维素的激活因子被发现[3]，之后的十几年中，研究者发现cdiGMP广泛存在于细菌中，调控细菌的多种重要生理生化功能，如细胞分化、生物膜形成、运动性和毒性等[4,5,6]。细菌中cdiGMP由2分子GTP在具有GGDEF保守结构域的鸟苷酸环化酶(DGCs)的催化下合成[7]，并可被含有EAL或HDGYP结构域的磷酸二酯酶(PDEs)降解[7]。含有GGDEF结构域的蛋白通常在其N端存在一个或多个与信号接收与传递相关的结构域（如PAS和GAF等）。当这些结构域感应胞内外某种或某些信号后，会激活或抑制相应DGCs的活性，从而改变胞内cdiGMP含量，进而通过cdiGMP下游特异的受体来调控细菌一系列重要的生理生化功能。目前，已报道的cdiGMP的受体包括：含有PilZ结构域的蛋白[8]，转录因子（如FleQ和CsgD）[9,10]，退化的GGDEF和EAL结构域[11]以及特异的核糖体开关[12,13]。总的来说，与cdiGMP结合或解离后，这些受体蛋白往往是通过蛋白蛋白互作(如PilZ受体)或者与靶标基因启动子的结合等方式（如转录因子），来影响基因表达调控，进而控制细菌的多种生理生化功能。
全基因组分析表明，胶状溶杆菌OH17含有24个与cdiGMP代谢相关的基因，包括12 个含有GGDEF结构域的蛋白，猜测这些蛋白可能参与了OH17中cdiGMP的合成，并通过影响该过程调控胞内cdiGMP的含量，从而发挥其调控功能。本研究拟通过PCR的方法从OH17中克隆这些含有GGDEF结构域的编码基因。在此基础上，利用课题组已建立的基因定向敲除策略，构建针对每一个基因的敲除载体，为后续成功缺失每一个合成基因，研究其生化和调控功能提供材料支撑。
1 材料与方法
1．1 菌种和质粒的来源
表一 本研究所用的菌株和质粒
Strains, plasmids
Characteristicsa
Source
Strains
E.coli Top10
F, φ80dlacZ?M15, ?(lacZYAargF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk,mk+), phoA, supE44, λ, thi1, gyrA96
Lab collection
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 菌种和质粒的来源2
1.2培养基和抗生素3
1.2.1培养基3
1.2.2 抗生素及其使用浓度3
1.3培养条件3
1.3.1 胶状溶杆菌OH17的培养与保存3
1.3.2大肠杆菌TOP10培养与保存3
1.4主要试剂3
1.5实验器材3
1．6 实验原理3
1.6.1敲除载体构建策略4
1.6.2同源重组原理4
1.7实验方法4
1.7.1 OH17基因组DNA的提取4
1.7.2引物的设计5
1.7.3 PCR反应体系及程序6
1.7.4琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物6
1.7.5 PCR产物纯化6
1.7.6 PCR扩增产物的凝胶回收7
1.7.7质粒pJQ200SK的提取7
1.7.8同源片段、质粒pJQ200S *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
K酶切8
1.7.9片段及载体的连接8
1.7.10 TOP10热转感受态的制备9
1.7.11连接产物的转化及验证9
1.7.12连接产物的转化及验证9
2 结果与分析9
2.1 从胶状溶杆菌OH17中鉴定了12个与cdiGMP合成相关的基因9
2.2 敲除载体构建及验证10
2.2.1构建获得重组质粒10
3讨论14
致谢 15
参考文献 15
胶状溶杆菌中第二信使cdiGMP合成相关基因的克隆及敲除载体的构建
引言
溶杆菌属于黄单胞科(Xanthomonadaceae)，溶杆菌属(Lysobacter)，是一类环境友好、但较难分离的有益革兰氏阴性细菌（Christensen & Cook, 1978）。这类细菌以产生结构多样的小分子抗菌（真菌、细菌等）物质而闻名，是一类新型抗菌代谢产物的重要来源，但未完全开发的生防细菌[1,2]。截止2014年，国际上报道的溶杆菌属细菌已达到22个种，包括4个典型种，即产酶溶杆菌（L. enzymogenes）、产抗生素溶杆菌（L. antibioticus）、胶状溶杆菌（L. gummosus）和变棕溶杆菌（L.brunescens）。
胶状溶杆菌OH17是本实验室从安徽水稻根际土壤中分离筛选到的一株对丝状真菌、酵母和卵菌均具有拮抗活性的菌株，具有自主知识产权。通过培养性状观察、生理生化测定以及基于16S rDNA的分子生物学研究，将该菌株鉴定为胶状溶杆菌（L. gummosus）。目前，本课题组已经完成了该菌株的基因组测序，并从中鉴定了12个与次生代谢产物相关的基因簇。同时，课题组也建立了OH17的遗传操作体系，实现了基因的定向敲除和互补。利用该操作体系，课题组正在研究这些基因簇的生物学功能期望从中发现与抗菌活性以及小分子抗菌物质的生物合成相关的基因簇。
与此同时，本课题组还期望利用基因遗传调控的手段来获得抗菌活性丧失或显著下降的突变株。通过对野生型OH17和这些突变株代谢产物的化学分析，快速定位与抗菌活性相关的小分子代谢物质，进而研究它们在OH17中的生物合成机理。本人的毕业实习课题就是围绕该总体目标来设计和开展相关实验的。具体来说，本人的研究目标是探索细菌新型第二信使环二鸟苷酸（cdiGMP）在胶状溶杆菌OH17抗菌活性发挥中的功能，主要聚焦OH17中cdiGMP合成相关基因的克隆及敲除载体的构建。
cdiGMP 或cyclic diguanylate 是细菌中新发现的一种第二信使，它于1987年作为Gluconacetobacter xylinus中合成纤维素的激活因子被发现[3]，之后的十几年中，研究者发现cdiGMP广泛存在于细菌中，调控细菌的多种重要生理生化功能，如细胞分化、生物膜形成、运动性和毒性等[4,5,6]。细菌中cdiGMP由2分子GTP在具有GGDEF保守结构域的鸟苷酸环化酶(DGCs)的催化下合成[7]，并可被含有EAL或HDGYP结构域的磷酸二酯酶(PDEs)降解[7]。含有GGDEF结构域的蛋白通常在其N端存在一个或多个与信号接收与传递相关的结构域（如PAS和GAF等）。当这些结构域感应胞内外某种或某些信号后，会激活或抑制相应DGCs的活性，从而改变胞内cdiGMP含量，进而通过cdiGMP下游特异的受体来调控细菌一系列重要的生理生化功能。目前，已报道的cdiGMP的受体包括：含有PilZ结构域的蛋白[8]，转录因子（如FleQ和CsgD）[9,10]，退化的GGDEF和EAL结构域[11]以及特异的核糖体开关[12,13]。总的来说，与cdiGMP结合或解离后，这些受体蛋白往往是通过蛋白蛋白互作(如PilZ受体)或者与靶标基因启动子的结合等方式（如转录因子），来影响基因表达调控，进而控制细菌的多种生理生化功能。
全基因组分析表明，胶状溶杆菌OH17含有24个与cdiGMP代谢相关的基因，包括12 个含有GGDEF结构域的蛋白，猜测这些蛋白可能参与了OH17中cdiGMP的合成，并通过影响该过程调控胞内cdiGMP的含量，从而发挥其调控功能。本研究拟通过PCR的方法从OH17中克隆这些含有GGDEF结构域的编码基因。在此基础上，利用课题组已建立的基因定向敲除策略，构建针对每一个基因的敲除载体，为后续成功缺失每一个合成基因，研究其生化和调控功能提供材料支撑。
1 材料与方法
1．1 菌种和质粒的来源
表一 本研究所用的菌株和质粒
Strains, plasmids
Characteristicsa
Source
Strains
E.coli Top10
F, φ80dlacZ?M15, ?(lacZYAargF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk,mk+), phoA, supE44, λ, thi1, gyrA96
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