mtdnacoi基因片段的树蜂科昆虫dna条形码的初步构建
树蜂科(Siricidae)昆虫是林业害虫中的一个重要组成部分，它传播快，危害大。近年来在我国进境木材和木质包装中经常被截获，尤其是检疫性生物云杉树蜂(Sirex noctilio) 更是频频出现。然而口岸上截获的树蜂往往出现虫体数量少、肢体残缺，或只有幼虫或卵的现象，难以准确鉴定；同时由于树蜂科的经济意义不大，过去研究较少，资料匮乏，加大了形态学鉴定的难度。DNA条形码技术的兴起，为解决这一难题提供了新的方法。本研究通过对树蜂科昆虫线粒体DNA COI基因序列进行分析，自行设计了适合树蜂科昆虫扩增的一对引物，并将该引物与通用引物结合，对基因组DNA进行巢式PCR扩增，成功扩增出9种树蜂科昆虫，同时通过研究扩增片段的遗传距离和系统进化关系，证明了该COI基因片段可以用作为树蜂科的DNA条形码。初步构建了树蜂科4属19种共24个树蜂的基因条形码库，为树蜂科的分子鉴定提供理论和实验依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法 2
1.1 实验标本 2
1.2 基因银行（GenBank）上下载COI序列3
1.3 基因组DNA提取3
1.4 COI基因扩增及测序3
1.5 序列编辑及分析4
1.6 DNA条形码库的初步构建4
2 结果与分析4
2.1 基因组DNA提取结果4
2.2 PCR扩增及电泳结果4
2.3 测序结果与分析4
2.3.1 序列组成和变异5
2.3.2 碱基替换分析5
2.3.3 遗传距离分析5
2.3.4 系统发育树的构建7
2.3.5 特殊序列8
2.4 DNA条形码库的构建8
3 讨论9
3.1 mtDNACOI基因片段作为树蜂科昆虫DNA条形码的可行性分析9
3.2利用DNA条形码鉴定物种时需要注意的问题10
致谢10
参考文献10
基于mtDNACOI基因片段的树蜂科昆虫DNA条形码的初步构建 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
引言
树蜂科(Siricidae)隶属膜翅目(Hymenoptera)广腰亚目(Symphyta)树蜂总科(Siricoidea)，是一类植物钻蛀性害虫，是林业昆虫群体中的一个重要组成部分，常常给林业生产造成巨大损失。树蜂科成虫大多在森林树木的树皮下、木质部中产卵以危害木材，幼虫在木质部钻蛀、啮食，常引起真菌寄生，降低木材工艺价值，严重时甚至造成林木的死亡。据报道，成虫羽化时还会造成电线短路，家具和房屋受损等。目前了解，所有松树均可受树蜂侵害，但也有些种类为害落叶阔叶树。过去由于树蜂科多数种类经济意义不大，故未引起重视[1]。但是近年来树蜂科个别种类传播广泛，发生猖獗，已在世界范围引起关注，国外就树蜂科中的个别种类对林业发展的为害和潜在威胁屡有报道，国内各大口岸检疫机关也不断在进境木质包装上截获各类树蜂，其中云杉树蜂Sirex noctilio（Fabricius）更是在最新公布的“进境植物检疫性有害生物名录”中榜上有名。
云杉树蜂本是欧洲和北非的本地种，后来通过木材运输传入新西兰，造成120,000公顷的干旱林区的约30%的辐射松死亡[2]；1981年在澳大利亚新南威尔发现云杉树蜂入侵，导当地致80%的3年以上的辐射松死亡[3]；之后几十年云杉树蜂传播至巴西、乌拉圭、南非和智利等其他南半球国家，成为南半球危害最严重的外来入侵生物之一。据国外相关报道，目前树蜂科害虫将不断地传播到世界各地[4]。随着我国加入WTO后，木材和木质包装材料进口数量逐年增多，检疫性树蜂随之传入我国的机会也大大增加，国内已有许多文章提醒我们警惕云杉树蜂传入中国，2002年时殷玉生等[3]即通过研究发现云杉树蜂传入中国的风险性极高，近年来戴秋莎的研究结果表明云杉树蜂一旦入侵中国将会造成我国林产品生产者52亿美元的年均损失总额[5]。
由此可见树蜂科害虫不仅对林业造成巨大威胁，甚至还影响到国际贸易，因此，加强树蜂科的检验检疫工作十分重要。目前，对树蜂科的形态特征鉴定是检疫系统常用的方法，然而，形态学鉴定主要以完整成虫为研究对象，截获的树蜂中有一部分为幼虫、卵或虫体不完整，使得形态学鉴定难以实现[6]，探索新的方法弥补形态鉴定的缺陷显得尤为重要和迫切。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于线粒体COI基因的DNA条形码技术已发展成为鉴定昆虫物种的一项新技术，为解决这一问题提供了方法。
目前，DNA 条形码技术已被广泛应用于各类昆虫鉴定中。诸立新等（2006）利用COI基因对凤尾蝶属4种蝴蝶进行了鉴定分类［7］。Monaghan等（2005）应用DNA序列鉴定了马达加斯加水生甲虫[8]；潘程莹等（2006）测定了7种蝗虫的COI基因序列，探讨了COI基因作为DNA条形码鉴定蝗虫物种的可行性［9］；常虹等(2012)的研究表明应用基于COI基因片段的DNA条形码进行齿小蠹属分类鉴定具有可行性[10]。
关于树蜂科COI基因作为DNA条形码技术的研究目前较少，2005年，Hoebeke 等首次提出了将DNA条形码技术用于云杉树蜂的鉴定，引发了关注，为此，Wilson和Schiff在2010年时研究了树蜂科COI基因序列以期区别云杉树蜂和当地物种[4]，2012年Nathan M.Schiff等利用COI基因对西半球的树蜂科物种进行了系统发育研究［11］，重新调整完善了树蜂科的系统分类方法。然而目前为止，树蜂的研究只是刚刚开始，尤其是国内，还没有对树蜂科进行分子鉴定的研究，关于树蜂科形态分类的资料也是寥寥无几。本研究旨在扩增树蜂科COI基因片段，分析遗传距离，构建系统进化树，检测该基因是否适合作为树蜂科的DNA条形码，并构建树蜂科DNA条形码库，为树蜂科的鉴定提供理论和数据依据。
材料与方法
1 实验标本
本研究所用标本由江苏出入境检验检疫局植物检疫实验室鉴定和提供，包括鉴定到种的树蜂科标本11种，所有供试标本均保存于无水乙醇中。标本信息见表1。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法 2
1.1 实验标本 2
1.2 基因银行（GenBank）上下载COI序列3
1.3 基因组DNA提取3
1.4 COI基因扩增及测序3
1.5 序列编辑及分析4
1.6 DNA条形码库的初步构建4
2 结果与分析4
2.1 基因组DNA提取结果4
2.2 PCR扩增及电泳结果4
2.3 测序结果与分析4
2.3.1 序列组成和变异5
2.3.2 碱基替换分析5
2.3.3 遗传距离分析5
2.3.4 系统发育树的构建7
2.3.5 特殊序列8
2.4 DNA条形码库的构建8
3 讨论9
3.1 mtDNACOI基因片段作为树蜂科昆虫DNA条形码的可行性分析9
3.2利用DNA条形码鉴定物种时需要注意的问题10
致谢10
参考文献10
基于mtDNACOI基因片段的树蜂科昆虫DNA条形码的初步构建 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
引言
树蜂科(Siricidae)隶属膜翅目(Hymenoptera)广腰亚目(Symphyta)树蜂总科(Siricoidea)，是一类植物钻蛀性害虫，是林业昆虫群体中的一个重要组成部分，常常给林业生产造成巨大损失。树蜂科成虫大多在森林树木的树皮下、木质部中产卵以危害木材，幼虫在木质部钻蛀、啮食，常引起真菌寄生，降低木材工艺价值，严重时甚至造成林木的死亡。据报道，成虫羽化时还会造成电线短路，家具和房屋受损等。目前了解，所有松树均可受树蜂侵害，但也有些种类为害落叶阔叶树。过去由于树蜂科多数种类经济意义不大，故未引起重视[1]。但是近年来树蜂科个别种类传播广泛，发生猖獗，已在世界范围引起关注，国外就树蜂科中的个别种类对林业发展的为害和潜在威胁屡有报道，国内各大口岸检疫机关也不断在进境木质包装上截获各类树蜂，其中云杉树蜂Sirex noctilio（Fabricius）更是在最新公布的“进境植物检疫性有害生物名录”中榜上有名。
云杉树蜂本是欧洲和北非的本地种，后来通过木材运输传入新西兰，造成120,000公顷的干旱林区的约30%的辐射松死亡[2]；1981年在澳大利亚新南威尔发现云杉树蜂入侵，导当地致80%的3年以上的辐射松死亡[3]；之后几十年云杉树蜂传播至巴西、乌拉圭、南非和智利等其他南半球国家，成为南半球危害最严重的外来入侵生物之一。据国外相关报道，目前树蜂科害虫将不断地传播到世界各地[4]。随着我国加入WTO后，木材和木质包装材料进口数量逐年增多，检疫性树蜂随之传入我国的机会也大大增加，国内已有许多文章提醒我们警惕云杉树蜂传入中国，2002年时殷玉生等[3]即通过研究发现云杉树蜂传入中国的风险性极高，近年来戴秋莎的研究结果表明云杉树蜂一旦入侵中国将会造成我国林产品生产者52亿美元的年均损失总额[5]。
由此可见树蜂科害虫不仅对林业造成巨大威胁，甚至还影响到国际贸易，因此，加强树蜂科的检验检疫工作十分重要。目前，对树蜂科的形态特征鉴定是检疫系统常用的方法，然而，形态学鉴定主要以完整成虫为研究对象，截获的树蜂中有一部分为幼虫、卵或虫体不完整，使得形态学鉴定难以实现[6]，探索新的方法弥补形态鉴定的缺陷显得尤为重要和迫切。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于线粒体COI基因的DNA条形码技术已发展成为鉴定昆虫物种的一项新技术，为解决这一问题提供了方法。
目前，DNA 条形码技术已被广泛应用于各类昆虫鉴定中。诸立新等（2006）利用COI基因对凤尾蝶属4种蝴蝶进行了鉴定分类［7］。Monaghan等（2005）应用DNA序列鉴定了马达加斯加水生甲虫[8]；潘程莹等（2006）测定了7种蝗虫的COI基因序列，探讨了COI基因作为DNA条形码鉴定蝗虫物种的可行性［9］；常虹等(2012)的研究表明应用基于COI基因片段的DNA条形码进行齿小蠹属分类鉴定具有可行性[10]。
关于树蜂科COI基因作为DNA条形码技术的研究目前较少，2005年，Hoebeke 等首次提出了将DNA条形码技术用于云杉树蜂的鉴定，引发了关注，为此，Wilson和Schiff在2010年时研究了树蜂科COI基因序列以期区别云杉树蜂和当地物种[4]，2012年Nathan M.Schiff等利用COI基因对西半球的树蜂科物种进行了系统发育研究［11］，重新调整完善了树蜂科的系统分类方法。然而目前为止，树蜂的研究只是刚刚开始，尤其是国内，还没有对树蜂科进行分子鉴定的研究，关于树蜂科形态分类的资料也是寥寥无几。本研究旨在扩增树蜂科COI基因片段，分析遗传距离，构建系统进化树，检测该基因是否适合作为树蜂科的DNA条形码，并构建树蜂科DNA条形码库，为树蜂科的鉴定提供理论和数据依据。
材料与方法
1 实验标本
本研究所用标本由江苏出入境检验检疫局植物检疫实验室鉴定和提供，包括鉴定到种的树蜂科标本11种，所有供试标本均保存于无水乙醇中。标本信息见表1。
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