藤仓镰孢菌对丙烯酸酯类杀菌剂氰烯菌酯潜在抗药性风险研究
由藤仓镰孢菌（Fusarium fujikuroi）引起的种传病害恶苗病是水稻生产中的瓶颈因子，严重威胁着我国的粮食安全。由于缺少抗病品种，利用杀菌剂进行种子处理是防治该病的关键措施。氰烯菌酯是一种结构新颖、作用方式独特、对环境友好、具有自主知识产权的丙烯酸酯类杀菌剂，对大多数镰孢菌具有优异的抑菌活性，能够治理镰孢菌对多菌灵和麦角甾醇生物合成抑制剂抗药性。在离体条件下，本研究成功获得了12株药剂驯化的高抗突变体；转接菌碟的抗药性突变频率高达12.9%，这远超过其他作用机制的杀菌剂；所获得的突变体致病力和菌丝生长显著降低，但是，产分生孢子能力显著提高；藤仓镰孢菌中myosin 1 点突变可能导致其对该药剂的抗药性。因此，认为藤仓镰孢菌对氰烯菌酯存在高水平的抗药性风险。建议在使用氰烯菌酯进行种子处理时，必须考虑用药频次和水平，建立一个科学用药方法，减低或者延缓田间抗药性的产生，延长药剂的使用寿命。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 2
1 材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1 供试菌株 2
1.1.2 供试药剂和培养基 2
1.2方法 2
1.2.1 PDA培养基的配置 2
1.2.2藤仓镰孢菌氰烯菌酯抗药性驯化突变体的获得 3
1.2.3高抗突变体生长速率测定 3
1.2.4高抗突变体致病力测定 3
1.2.5高抗突变体的产孢能力测定 3
1.2.6 藤仓镰孢菌myosin1基因的克隆及抗/感菌株中该基因的序列分析 4
2 结果与分析5
2.1藤仓镰孢菌对氰烯菌酯抗药性驯化突变体的获得5
2.2藤仓镰孢菌对氰烯菌酯高抗突变体生物学性质研究5
2.2.1 菌落生长速率 5
2.2.2 致病力 6
2.2.3 产分生孢子能力 7
2.3 藤仓镰孢菌myosin1 基因全长的克隆 7
2.4藤仓镰孢菌对氰烯菌酯不同敏感性水平菌株中myosin1 基因比对分析 8
3 讨论 8 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
致谢8
参考文献9
藤仓镰孢菌对丙烯酸酯类杀菌剂氰烯菌酯潜在抗药性风险研究
引言
由藤仓镰孢菌（Fusarium fujikuroi） 引起的种传病害水稻恶苗病，是我国水稻生产中重要的病害之一，在各个水稻主产区均有发生。该病主要靠带菌种子传播，发病率高，对水稻生产威胁很大，一般可减产10%～20%，严重的达50%以上。由于缺少有效的抗病性品种，生产上主要采用杀菌剂进行种子处理进行防治。在上世纪八十年代，利用苯并咪唑类杀菌剂多菌灵进行种子处理，防效优良。但是23年后，田间即可检测到抗药性群体，于1990年前后丧失防效，停用。替代多菌灵的药剂为麦角甾醇生物合成抑制剂（如咪鲜胺）和浸种灵（有效成分为二硫氰基甲烷）进行种子处理。但是，前者使用十年左右，发现抗药性逐年加重，于本世纪初逐渐停用；后者不仅能够有效防控水稻恶苗病，而且对水稻干尖线虫病也具有优异防效，但是由于临时登记时限已满，没有进行正式登记而退出市场。因此，该病防控急需寻找替代药剂！
氰烯菌酯是一种结构新颖、作用方式独特、具有完全自主知识产权的丙烯酸酯类杀菌剂。该药剂由江苏省农药研究所1998年创制，2001年进入田间试验。目前，己获得中国发明专利，2005年完成农药临时登记。氰烯菌酯英文通用名为:phenamacril；IUPAC名为：ethyl (2EZ)2cyano3am ino3phenylacrylate；化学名称为：2氰基3氨基3苯基丙烯酸乙酯；试验代号为：JS39919、JS399；分子式为：C12H12N2O2；相对分子质量为：216.23。氰烯菌酯纯品为白色或淡黄色固体，原药含量≥95%。熔点(纯品):117—119℃。难溶于石油醚、甲苯等非极性溶剂，易溶于氯仿、丙酮、二甲亚砜、N ,N二甲基甲酰胺等极性溶剂。目前该药是防控小麦赤霉病和有效治理多菌灵抗药性的主流药剂；不仅能够防治小麦赤霉病，而且能够有效抑制引起该病的病原菌毒素合成；对大多数镰孢菌具有优异的抑菌活性；对作物安全。
已有的研究表明，氰烯菌酯作用位点单一，选择性强，在离体条件下容易获得对该药剂产生抗药性的小麦赤霉病菌，具有较高的潜在抗药性风险。由于藤仓镰孢菌尽管是一种种传病害，但是，其再侵染严重，是具有高抗药性风险的植物病原菌，这与小麦赤霉病菌截然不同！为此，进行藤仓镰孢菌对氰烯菌酯的离体抗药性风险评估，为制定科学的水稻恶苗病防控策略具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株
从水稻茎秆上分离3株单孢菌株为出发菌株。
1.1.2 供试药剂和培养基
95%氰烯菌醋原药由国家南方农药创制中心江苏基地提供，预溶于甲醇中，制成1* 104μg/mL母液，4℃保存，备用。
菌落生长培养基：PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）。
产分生孢子培养基：10%绿豆汤。
1.2 方法
1.2.1 PDA培养基的配置
1.2.1.1称量和熬煮
按培养基配方称取土豆。将土豆去皮，切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持2030min，用可用2层纱布趁热在量杯上过滤，弃掉滤渣。滤液补充水分到1000ml。
1.2.1.2 加热溶解
把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g(提前搞碎)，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所需量。
1.2.1.3 分装
按照要求，将配制的培养基分装入500ml锥形瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染。
分装量：固体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后制成斜面，分装入锥形瓶内以不超过其容积的一半为宜；半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
1.2.1.4 封口
培养基分装完毕后，在锥形瓶瓶口上用封口膜封住，然后用橡皮筋捆好，以阻止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。用记号笔注明培养基名称、配制日期。
1.2.1.5 灭菌
将处理好的培养基放入灭菌锅灭菌。灭好菌后，冷却到室温，备用。
1.2.2 藤仓镰孢菌氰烯菌酯抗药性驯化突变体的获得
使用离体药剂驯化方法。将从病茎上分离后保存的单孢菌株首先在PDA培养基上活化二次，转接到PDA平板，置25℃倒置培养6天后，用打孔器在菌落外周1/3处打制菌碟，转移到含氰烯菌酯浓度为0、50、100、400μg/mL含药培养基上培养抗药性菌株。用此方法，逐渐提高氰烯菌酯浓度培养，直到抗药性菌株都能在氰烯菌酯浓度为600μg/mL的PDA培养基上稳定生长；再转接PDA6次后，进行抗药性菌株生物学测定。
1.2.3 高抗突变体生长速率测定
采用菌丝生长速率测定法，从PDA平板上预培养的菌落边缘打取菌碟（直径5mm），转接到直径为9 cm的PDA平板；每皿接种一菌碟，菌丝面朝下；每处理重复3次。25℃倒置培养7天后，用“十”字交叉法测量菌落增长直径；扣除菌碟直径5mm后进行数据分析。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 2
1 材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1 供试菌株 2
1.1.2 供试药剂和培养基 2
1.2方法 2
1.2.1 PDA培养基的配置 2
1.2.2藤仓镰孢菌氰烯菌酯抗药性驯化突变体的获得 3
1.2.3高抗突变体生长速率测定 3
1.2.4高抗突变体致病力测定 3
1.2.5高抗突变体的产孢能力测定 3
1.2.6 藤仓镰孢菌myosin1基因的克隆及抗/感菌株中该基因的序列分析 4
2 结果与分析5
2.1藤仓镰孢菌对氰烯菌酯抗药性驯化突变体的获得5
2.2藤仓镰孢菌对氰烯菌酯高抗突变体生物学性质研究5
2.2.1 菌落生长速率 5
2.2.2 致病力 6
2.2.3 产分生孢子能力 7
2.3 藤仓镰孢菌myosin1 基因全长的克隆 7
2.4藤仓镰孢菌对氰烯菌酯不同敏感性水平菌株中myosin1 基因比对分析 8
3 讨论 8 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
致谢8
参考文献9
藤仓镰孢菌对丙烯酸酯类杀菌剂氰烯菌酯潜在抗药性风险研究
引言
由藤仓镰孢菌（Fusarium fujikuroi） 引起的种传病害水稻恶苗病，是我国水稻生产中重要的病害之一，在各个水稻主产区均有发生。该病主要靠带菌种子传播，发病率高，对水稻生产威胁很大，一般可减产10%～20%，严重的达50%以上。由于缺少有效的抗病性品种，生产上主要采用杀菌剂进行种子处理进行防治。在上世纪八十年代，利用苯并咪唑类杀菌剂多菌灵进行种子处理，防效优良。但是23年后，田间即可检测到抗药性群体，于1990年前后丧失防效，停用。替代多菌灵的药剂为麦角甾醇生物合成抑制剂（如咪鲜胺）和浸种灵（有效成分为二硫氰基甲烷）进行种子处理。但是，前者使用十年左右，发现抗药性逐年加重，于本世纪初逐渐停用；后者不仅能够有效防控水稻恶苗病，而且对水稻干尖线虫病也具有优异防效，但是由于临时登记时限已满，没有进行正式登记而退出市场。因此，该病防控急需寻找替代药剂！
氰烯菌酯是一种结构新颖、作用方式独特、具有完全自主知识产权的丙烯酸酯类杀菌剂。该药剂由江苏省农药研究所1998年创制，2001年进入田间试验。目前，己获得中国发明专利，2005年完成农药临时登记。氰烯菌酯英文通用名为:phenamacril；IUPAC名为：ethyl (2EZ)2cyano3am ino3phenylacrylate；化学名称为：2氰基3氨基3苯基丙烯酸乙酯；试验代号为：JS39919、JS399；分子式为：C12H12N2O2；相对分子质量为：216.23。氰烯菌酯纯品为白色或淡黄色固体，原药含量≥95%。熔点(纯品):117—119℃。难溶于石油醚、甲苯等非极性溶剂，易溶于氯仿、丙酮、二甲亚砜、N ,N二甲基甲酰胺等极性溶剂。目前该药是防控小麦赤霉病和有效治理多菌灵抗药性的主流药剂；不仅能够防治小麦赤霉病，而且能够有效抑制引起该病的病原菌毒素合成；对大多数镰孢菌具有优异的抑菌活性；对作物安全。
已有的研究表明，氰烯菌酯作用位点单一，选择性强，在离体条件下容易获得对该药剂产生抗药性的小麦赤霉病菌，具有较高的潜在抗药性风险。由于藤仓镰孢菌尽管是一种种传病害，但是，其再侵染严重，是具有高抗药性风险的植物病原菌，这与小麦赤霉病菌截然不同！为此，进行藤仓镰孢菌对氰烯菌酯的离体抗药性风险评估，为制定科学的水稻恶苗病防控策略具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株
从水稻茎秆上分离3株单孢菌株为出发菌株。
1.1.2 供试药剂和培养基
95%氰烯菌醋原药由国家南方农药创制中心江苏基地提供，预溶于甲醇中，制成1* 104μg/mL母液，4℃保存，备用。
菌落生长培养基：PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）。
产分生孢子培养基：10%绿豆汤。
1.2 方法
1.2.1 PDA培养基的配置
1.2.1.1称量和熬煮
按培养基配方称取土豆。将土豆去皮，切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持2030min，用可用2层纱布趁热在量杯上过滤，弃掉滤渣。滤液补充水分到1000ml。
1.2.1.2 加热溶解
把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g(提前搞碎)，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所需量。
1.2.1.3 分装
按照要求，将配制的培养基分装入500ml锥形瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染。
分装量：固体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后制成斜面，分装入锥形瓶内以不超过其容积的一半为宜；半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
1.2.1.4 封口
培养基分装完毕后，在锥形瓶瓶口上用封口膜封住，然后用橡皮筋捆好，以阻止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。用记号笔注明培养基名称、配制日期。
1.2.1.5 灭菌
将处理好的培养基放入灭菌锅灭菌。灭好菌后，冷却到室温，备用。
1.2.2 藤仓镰孢菌氰烯菌酯抗药性驯化突变体的获得
使用离体药剂驯化方法。将从病茎上分离后保存的单孢菌株首先在PDA培养基上活化二次，转接到PDA平板，置25℃倒置培养6天后，用打孔器在菌落外周1/3处打制菌碟，转移到含氰烯菌酯浓度为0、50、100、400μg/mL含药培养基上培养抗药性菌株。用此方法，逐渐提高氰烯菌酯浓度培养，直到抗药性菌株都能在氰烯菌酯浓度为600μg/mL的PDA培养基上稳定生长；再转接PDA6次后，进行抗药性菌株生物学测定。
1.2.3 高抗突变体生长速率测定
采用菌丝生长速率测定法，从PDA平板上预培养的菌落边缘打取菌碟（直径5mm），转接到直径为9 cm的PDA平板；每皿接种一菌碟，菌丝面朝下；每处理重复3次。25℃倒置培养7天后，用“十”字交叉法测量菌落增长直径；扣除菌碟直径5mm后进行数据分析。
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