产酶溶杆菌oh11中两种核苷酸合成相关基因的克隆及功能分析
产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)属于黄单胞科(Xanthomonadaceae)、溶杆菌属(Lysobacter)，是一种不同于芽孢杆菌和假单胞杆菌的新型生防细菌。热稳定抗真菌因子HSAF和抗细菌物质WAP-89294A2是产酶溶杆菌中新发现的两种小分子抗菌物质。环化核苷酸是细菌中的第二信使，能够调控多种生物学功能。本研究以产酶溶杆菌菌株OH11为研究对象，意图解析第二信使在生防细菌OH11中所发挥的功能。通过全基因组扫描，克隆到两个分别与cAMP（环腺苷酸）和c-di-GMP（环二鸟苷酸）合成相关的基因，命名为lys384和lys385。Lys384蛋白含有CyaA结构域，推测具有腺苷酸环化酶(ACs)活性，参与cAMP的合成；Lys385蛋白含有GGDEF结构域，推测具有鸟苷酸环化酶(DGCs)活性，参与c-di-GMP的合成。利用基因同源重组原理，分别构建了lys384和lys385的缺失突变体以其及相应的过表达菌株，并开展了功能研究，结果表明lys384和lys385的缺失或者过表达均不影响HSAF和WAP-89294A2的产量，也不改变胞外水解酶活性和抗菌能力，但lys385基因的过表达导致菌落表面湿润，推测该基因可能参与调控了细菌胞外多糖的合成。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法 2
1．1 菌种和质粒的来源3
1．2 培养基和抗生素3
1．2．1 培养基3
1．2．2 抗生素及其使用浓度3
1．3 培养条件3
1．3．1 产酶溶杆菌OH11的培养与保存3
1．3．2 大肠杆菌TOP10的培养与保存4
1．4 主要试剂4
1．5 实验器材4
1．6 实验原理4
1．6．1 敲除载体构建策略4
1．6．2 同源重组原理4
1．7 实验方法5
1．7．1 lys384和lys385基因敲除载体的构建5
1．7．2 一次交换子的获得及验证6< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
br /> 1．7．3 二次交换及缺陷株筛选7
1．7．4 缺失突变体功能互补菌株的构建7
1．7．5 lys384和lys385功能分析8
2 结果与分析8
2．1 敲除载体构建及验证8
2．1．1 扩增lys384和lys385的上下游片段9
2．1．2 构建获得重组质粒9
2．1．3 一次交换子的获得以及验证9
2．2 二次交换结果分析10
2．3 过表达菌株的构建及验证10
2．4 lys384和lys385功能验证10
2．4．1 真菌与细菌拮抗结果10
2．4．2 胞外酶活性检测结果11
2．4．3 WAP89294A2和HSAF的HPLC检测结果12
3 讨论13
致谢14
参考文献14
产酶溶杆菌OH11两种核苷酸合成相关基因的克隆及功能分析
引言
产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)属于黄单胞科(Xanthomonadaceae)、溶杆菌属(Lysobacter)，是一种重要的生防细菌[1]。在拮抗试验中，该菌对许多植物病原真菌、卵菌、革兰氏阳性细菌、阴性细菌以及线虫均具有显著的拮抗作用[2][3][4]。在温室和田间的生防试验中，该菌也能对多种植物真菌病害（如小麦赤霉病、稻瘟病、梨炭疽病、草坪草叶斑病）、卵菌病害（如番茄猝倒病）及部分细菌病害（如番茄青枯病）表现出较好的生防效果[5][6][7]。该菌易于培养、发酵和保存，防效稳定，对环境友好，是一种具有明确应用前景的生防细菌[8]。
目前，产酶溶杆菌的生防机理主要归纳为：（1）分泌产生大量胞外酶，包括几丁质酶、(1,3葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、磷酸酶，能降解真菌、卵菌等微生物的细胞壁；（2）产生抗生素，如从产酶溶杆菌C3菌株及本课题组OH11菌株中鉴定的新型抗生素HSAF(Heat Stable Antifungal Factor)[9][10]；（3）在植物内定殖和抗生[11]；（4）诱导抗病性[12]。
HSAF是研究人员从产酶溶杆菌C3和OH11菌株中分离出的一种次生抗菌物质[13]。该物质对蛋白酶不敏感，对热极其稳定。结构鉴定表明： HSAF的分子量为513.2959，其结构中含有一个独特的大环内酰胺体系和一个四胺酸结构单元和5,5,6三环骨架，这一结构与目前市场上所有的杀真菌剂的结构均不一致。在作用活性方面，低浓度的HSAF(20μg/mL)可以使病菌孢子萌发后呈畸形或使菌丝分支出现紊乱，而高浓度的HSAF(40μg/mL)则完全抑制病菌孢子的萌发和菌丝的生长[14]。在植物上，HSAF可以抑制病原真菌附着孢的形成，从而减少病害的发生，降低危害程度。HSAF虽可识别不同类型的鞘脂，但只对丝状真菌有抑制活性，对哺乳动物和植物不起作用。因此，HSAF可以代表一类具有新型结构和独特作用方式、对环境友好的生物杀菌剂。WAP89294A2是产酶溶杆菌属分泌的一种重要的次生代谢产物，不具有热稳定性，但对革兰氏阳性细菌具有很好的拮抗活性，同时，该物质对感染人类的金黄色葡萄球菌也具有较强的作用活性，与市场上常用的抗生素即万古霉素相比其作用活性提高了近50倍。目前，本课题组与合作者已完成了产酶溶杆菌中WAP89294A2生物合成基因簇的结构分析，明确了生物合成所需的关键基因种类与数量，为利用微生物发酵工程开发基于WAP89294A2的杀菌剂或抗菌药物奠定基础。
第二信使是信号转导过程中的细胞内信号，在细胞信号转导中起重要作用，它们能够激活级联系统中酶的活性，以及非酶蛋白的活性，也控制着细胞的增殖、分化和生存，并参与基因转录的调节。环化酶是第二信使生物合成的关键酶。含有GGDEF结构域的蛋白具有鸟苷酸环化酶(DGCs)的活性，负责cdiGMP的合成[15]；而腺苷酸环化酶(ACs)含有CyaA结构域负责合成cAMP[16]。基因组扫描发现，产酶溶杆菌OH11中含有2个基因，代号分别为lys384和 lys385，其中lys385含有GGDEF结构域和一个cNMP_binding结构域；而 lys384含有CyaA结构域，揭示这两个基因所编码的蛋白可能参与cdiGMP和cAMP的生物合成。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法 2
1．1 菌种和质粒的来源3
1．2 培养基和抗生素3
1．2．1 培养基3
1．2．2 抗生素及其使用浓度3
1．3 培养条件3
1．3．1 产酶溶杆菌OH11的培养与保存3
1．3．2 大肠杆菌TOP10的培养与保存4
1．4 主要试剂4
1．5 实验器材4
1．6 实验原理4
1．6．1 敲除载体构建策略4
1．6．2 同源重组原理4
1．7 实验方法5
1．7．1 lys384和lys385基因敲除载体的构建5
1．7．2 一次交换子的获得及验证6< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
br /> 1．7．3 二次交换及缺陷株筛选7
1．7．4 缺失突变体功能互补菌株的构建7
1．7．5 lys384和lys385功能分析8
2 结果与分析8
2．1 敲除载体构建及验证8
2．1．1 扩增lys384和lys385的上下游片段9
2．1．2 构建获得重组质粒9
2．1．3 一次交换子的获得以及验证9
2．2 二次交换结果分析10
2．3 过表达菌株的构建及验证10
2．4 lys384和lys385功能验证10
2．4．1 真菌与细菌拮抗结果10
2．4．2 胞外酶活性检测结果11
2．4．3 WAP89294A2和HSAF的HPLC检测结果12
3 讨论13
致谢14
参考文献14
产酶溶杆菌OH11两种核苷酸合成相关基因的克隆及功能分析
引言
产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)属于黄单胞科(Xanthomonadaceae)、溶杆菌属(Lysobacter)，是一种重要的生防细菌[1]。在拮抗试验中，该菌对许多植物病原真菌、卵菌、革兰氏阳性细菌、阴性细菌以及线虫均具有显著的拮抗作用[2][3][4]。在温室和田间的生防试验中，该菌也能对多种植物真菌病害（如小麦赤霉病、稻瘟病、梨炭疽病、草坪草叶斑病）、卵菌病害（如番茄猝倒病）及部分细菌病害（如番茄青枯病）表现出较好的生防效果[5][6][7]。该菌易于培养、发酵和保存，防效稳定，对环境友好，是一种具有明确应用前景的生防细菌[8]。
目前，产酶溶杆菌的生防机理主要归纳为：（1）分泌产生大量胞外酶，包括几丁质酶、(1,3葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、磷酸酶，能降解真菌、卵菌等微生物的细胞壁；（2）产生抗生素，如从产酶溶杆菌C3菌株及本课题组OH11菌株中鉴定的新型抗生素HSAF(Heat Stable Antifungal Factor)[9][10]；（3）在植物内定殖和抗生[11]；（4）诱导抗病性[12]。
HSAF是研究人员从产酶溶杆菌C3和OH11菌株中分离出的一种次生抗菌物质[13]。该物质对蛋白酶不敏感，对热极其稳定。结构鉴定表明： HSAF的分子量为513.2959，其结构中含有一个独特的大环内酰胺体系和一个四胺酸结构单元和5,5,6三环骨架，这一结构与目前市场上所有的杀真菌剂的结构均不一致。在作用活性方面，低浓度的HSAF(20μg/mL)可以使病菌孢子萌发后呈畸形或使菌丝分支出现紊乱，而高浓度的HSAF(40μg/mL)则完全抑制病菌孢子的萌发和菌丝的生长[14]。在植物上，HSAF可以抑制病原真菌附着孢的形成，从而减少病害的发生，降低危害程度。HSAF虽可识别不同类型的鞘脂，但只对丝状真菌有抑制活性，对哺乳动物和植物不起作用。因此，HSAF可以代表一类具有新型结构和独特作用方式、对环境友好的生物杀菌剂。WAP89294A2是产酶溶杆菌属分泌的一种重要的次生代谢产物，不具有热稳定性，但对革兰氏阳性细菌具有很好的拮抗活性，同时，该物质对感染人类的金黄色葡萄球菌也具有较强的作用活性，与市场上常用的抗生素即万古霉素相比其作用活性提高了近50倍。目前，本课题组与合作者已完成了产酶溶杆菌中WAP89294A2生物合成基因簇的结构分析，明确了生物合成所需的关键基因种类与数量，为利用微生物发酵工程开发基于WAP89294A2的杀菌剂或抗菌药物奠定基础。
第二信使是信号转导过程中的细胞内信号，在细胞信号转导中起重要作用，它们能够激活级联系统中酶的活性，以及非酶蛋白的活性，也控制着细胞的增殖、分化和生存，并参与基因转录的调节。环化酶是第二信使生物合成的关键酶。含有GGDEF结构域的蛋白具有鸟苷酸环化酶(DGCs)的活性，负责cdiGMP的合成[15]；而腺苷酸环化酶(ACs)含有CyaA结构域负责合成cAMP[16]。基因组扫描发现，产酶溶杆菌OH11中含有2个基因，代号分别为lys384和 lys385，其中lys385含有GGDEF结构域和一个cNMP_binding结构域；而 lys384含有CyaA结构域，揭示这两个基因所编码的蛋白可能参与cdiGMP和cAMP的生物合成。
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