赤眼蜂分子鉴定
赤眼蜂(Trichogramma spp.)是全世界害虫生物防治中研究最多、应用最广的一类卵寄生性天敌，广泛用于防治玉米、水稻、棉花、蔬菜以及森林害虫，在农业害虫防治的应用实践中，赤眼蜂蜂种的正确鉴别是取得良好防治效果的关键。赤眼蜂属个体微小,近缘种间形态难辨，近年来,随着分子生物技术的发展,国内外研究者曾用不同分子标记方法来进行赤眼蜂蜂种的分子鉴别,然而每种分子标记都有自己的不足,且赤眼蜂分子鉴定中用于序列分析的标记基因主要有核糖体核糖核酸基因（rDNA）和线粒体基因（mtDNA）。本研究利用分子手段，主要以桃园所采集的赤眼蜂为研究材料，扩增赤眼蜂的mtDNA Cytb基因片段，利用Cytb基因片段在NCBI网站的BLAST并确定蜂种，设计、筛选蜂种的特异性引物，利用分子标记方法鉴定赤眼蜂蜂种。本研究鉴定出松毛虫赤眼蜂、稻螟赤眼蜂、玉米螟赤眼蜂、螟黄赤眼蜂等4种赤眼蜂，松毛赤眼蜂、稻螟赤眼蜂分别找到了1对引物，玉米螟赤眼蜂、螟黄赤眼蜂分别找到了2对引物。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料2
1.1.1供试虫源2
1.1.2主要实验仪器及试剂2
1.2方法 3
1.2.1赤眼蜂基因组DNA提取3
1.2.2 mtDNA基因片段特异扩增引物3
1.2.3扩增反应体系3
1.2.4扩增产物检测4
1.2.5测序4
1.2.6 DNA序列数据分析4
1.2.7赤眼蜂蜂种特异引物设计4
1.2.8赤眼蜂蜂种特异引物的筛选5
1.2.9赤眼蜂蜂种的PCR鉴定5
2结果与分析5
2.1赤眼蜂DNA提取结果5
2.2 PCR产物检测5
2.2.1松毛虫赤眼蜂5
2.2.2稻螟赤眼蜂6
2.2.3玉米螟赤眼蜂7
2.2.4螟黄赤眼蜂8 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
3讨论8
致谢9
参考文献9 南京桃园赤眼蜂的分子鉴定
引言
赤眼蜂(Trichogramma spp.)是全世界害虫生物防治中研究最多、应用最广的一类卵寄生性天敌,广泛用于防治玉米、水稻、甘蔗、棉花、蔬菜和松树的鳞翅目害虫。在农业害虫防治的应用中,赤眼蜂种的正确鉴别是取得良好防治效果的关键。随着分子生物学技术的发展,不同学者曾用测序和蜂种诊断技术来讨论研究赤眼蜂的分子鉴定（李正西和沈佐锐，2001，2002；耿金虎等；2005）。
线粒体基因广泛存在于昆虫体内富含线粒体的飞行肌和卵内,具有结构简单、序列和组成一般保守、易于操作、母系遗传、无重组、单拷贝、含量丰富等特点,目前线粒体基因己广泛用于研究昆虫系统发育、行为进化、种群遗传变异和分化,以及难以从形态学角度区分的近缘种的鉴别,种下分类单元的鉴定等方面的问题。线粒体DNA（mtDNA）具有分子量小,进化速率较快,遗传过程不发生基因重组、倒位、易位等突变,并且遵守严格的母系遗传方式等特点（Marjorie，2003），使得它很适合于种的鉴定。
陈轶等人利用雄虫的外生殖器特征及 ITS2 序列聚类分析方法对采获的赤眼蜂种类进行鉴定，鉴定出 7 个不同的赤眼蜂种类，其中小灰蝶分索赤眼蜂 Trichogrammatoidea hypsipylae Nagaraja 为中国新记录种，广赤眼蜂Trichogramma evanescense Westwood，食胚赤眼蜂 Trichogramma embryophyagum (Harting)及暗黑赤眼蜂 Trichogramma pintoi Voegele 为广东省内首次采获。采集鉴定结果表明，广东省本地具有丰富的赤眼蜂优质种质资源，可为害虫生物防治提供更大的筛选利用空间（陈轶等，2011）。但根据外形鉴定的方法常常耗时费力,非分类专家很难胜任。
近年来线粒体基因的应用越来越普遍，如：付海滨对来自国内外多种不同赤眼蜂种及同种不同地理种群的线粒体、和基因用于赤眼蜂种及种下阶元鉴定的可行性进行分析,这项研究成功测得了多种赤眼蜂不同种和不同地理种群mtDNA的基因序列,对赤眼蜂mtDNA基因序列从遗传距离和系统进化树进行分析,结果表明3个基因序列均适合赤眼蜂种一级的分子鉴定,不能用做种下阶元的区分,同时确定mtDNA基因为赤眼蜂蜂种鉴定的理想基因序列（付海滨，2006）。
目前,分子生物学技术应用于赤眼蜂种类鉴定和系统进化研究已经起步。赤眼蜂是广泛应用于田间鳞翅目害虫生物防治的卵寄生蜂,但由于该蜂个体微小、缺乏足够的形态学鉴定特征,赤眼蜂的鉴定一直非常困难,至今一些种分类地位仍然存疑。不同的研究者曾经采用不同的方法澄清赤眼蜂的分类问题,如:雄性外生殖器的形态比较(Nagarkatti and Nagaraja, 1971, 1977)等。然而有关赤眼蜂的分类仍存在许多争议,而且根据外形鉴定的方法常常耗时费力,非分类专家很难胜任。近来,采用PCR技术扩增DNA已成为研究赤眼蜂的分类鉴定和系统进化问题的重要方法(Landry et al., 1993)。
Cytb基因是mtDNA中蛋白质编码基因中较长的一个基因,是目前结构和功能研究得最为清楚的基因之一（Gray et al.，1989）。本研究根据第二章实验测得的松毛虫赤眼蜂、玉米螟赤眼蜂、螟黄赤眼蜂和甘蓝夜蛾赤眼蜂线粒体细胞色素b（mtDNACytb）基因485bp序列,设计了4种赤眼蜂的特异PCR引物,以期用PCR方法对生物防治中4种重要的赤眼蜂进行快速、准确的鉴定,建立赤眼蜂快速的鉴定和检测技术。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试虫源
本研究中使用了桃园所采集的赤眼蜂。
采集时间：2015年5月2015年11月
采集周期：每周
采集地点：桃园
1.1.2主要实验仪器及试剂
PCR仪（MJ Resarch公司, PTC200） 凝胶成像系统(BioRad)
多功能电泳仪(BioRad) 温控水浴器（Memmert）
移液器（Gilson、Eppendorf） 恒温培养箱(GXZ型，宁波江南仪器厂)
电子天平(Sartorius) 显微镜和解剖镜（Leica MZ9.5，DMR）
恒温混匀器（Eppendorf Thermomix） 超低温冰箱（Thermo）
冰箱（Siemens） 离心机（Eppendorf）
全自动蒸气灭菌锅（Tomy SS3251） 制冰机（Sanyo SIMF124）
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料2
1.1.1供试虫源2
1.1.2主要实验仪器及试剂2
1.2方法 3
1.2.1赤眼蜂基因组DNA提取3
1.2.2 mtDNA基因片段特异扩增引物3
1.2.3扩增反应体系3
1.2.4扩增产物检测4
1.2.5测序4
1.2.6 DNA序列数据分析4
1.2.7赤眼蜂蜂种特异引物设计4
1.2.8赤眼蜂蜂种特异引物的筛选5
1.2.9赤眼蜂蜂种的PCR鉴定5
2结果与分析5
2.1赤眼蜂DNA提取结果5
2.2 PCR产物检测5
2.2.1松毛虫赤眼蜂5
2.2.2稻螟赤眼蜂6
2.2.3玉米螟赤眼蜂7
2.2.4螟黄赤眼蜂8 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
3讨论8
致谢9
参考文献9 南京桃园赤眼蜂的分子鉴定
引言
赤眼蜂(Trichogramma spp.)是全世界害虫生物防治中研究最多、应用最广的一类卵寄生性天敌,广泛用于防治玉米、水稻、甘蔗、棉花、蔬菜和松树的鳞翅目害虫。在农业害虫防治的应用中,赤眼蜂种的正确鉴别是取得良好防治效果的关键。随着分子生物学技术的发展,不同学者曾用测序和蜂种诊断技术来讨论研究赤眼蜂的分子鉴定（李正西和沈佐锐，2001，2002；耿金虎等；2005）。
线粒体基因广泛存在于昆虫体内富含线粒体的飞行肌和卵内,具有结构简单、序列和组成一般保守、易于操作、母系遗传、无重组、单拷贝、含量丰富等特点,目前线粒体基因己广泛用于研究昆虫系统发育、行为进化、种群遗传变异和分化,以及难以从形态学角度区分的近缘种的鉴别,种下分类单元的鉴定等方面的问题。线粒体DNA（mtDNA）具有分子量小,进化速率较快,遗传过程不发生基因重组、倒位、易位等突变,并且遵守严格的母系遗传方式等特点（Marjorie，2003），使得它很适合于种的鉴定。
陈轶等人利用雄虫的外生殖器特征及 ITS2 序列聚类分析方法对采获的赤眼蜂种类进行鉴定，鉴定出 7 个不同的赤眼蜂种类，其中小灰蝶分索赤眼蜂 Trichogrammatoidea hypsipylae Nagaraja 为中国新记录种，广赤眼蜂Trichogramma evanescense Westwood，食胚赤眼蜂 Trichogramma embryophyagum (Harting)及暗黑赤眼蜂 Trichogramma pintoi Voegele 为广东省内首次采获。采集鉴定结果表明，广东省本地具有丰富的赤眼蜂优质种质资源，可为害虫生物防治提供更大的筛选利用空间（陈轶等，2011）。但根据外形鉴定的方法常常耗时费力,非分类专家很难胜任。
近年来线粒体基因的应用越来越普遍，如：付海滨对来自国内外多种不同赤眼蜂种及同种不同地理种群的线粒体、和基因用于赤眼蜂种及种下阶元鉴定的可行性进行分析,这项研究成功测得了多种赤眼蜂不同种和不同地理种群mtDNA的基因序列,对赤眼蜂mtDNA基因序列从遗传距离和系统进化树进行分析,结果表明3个基因序列均适合赤眼蜂种一级的分子鉴定,不能用做种下阶元的区分,同时确定mtDNA基因为赤眼蜂蜂种鉴定的理想基因序列（付海滨，2006）。
目前,分子生物学技术应用于赤眼蜂种类鉴定和系统进化研究已经起步。赤眼蜂是广泛应用于田间鳞翅目害虫生物防治的卵寄生蜂,但由于该蜂个体微小、缺乏足够的形态学鉴定特征,赤眼蜂的鉴定一直非常困难,至今一些种分类地位仍然存疑。不同的研究者曾经采用不同的方法澄清赤眼蜂的分类问题,如:雄性外生殖器的形态比较(Nagarkatti and Nagaraja, 1971, 1977)等。然而有关赤眼蜂的分类仍存在许多争议,而且根据外形鉴定的方法常常耗时费力,非分类专家很难胜任。近来,采用PCR技术扩增DNA已成为研究赤眼蜂的分类鉴定和系统进化问题的重要方法(Landry et al., 1993)。
Cytb基因是mtDNA中蛋白质编码基因中较长的一个基因,是目前结构和功能研究得最为清楚的基因之一（Gray et al.，1989）。本研究根据第二章实验测得的松毛虫赤眼蜂、玉米螟赤眼蜂、螟黄赤眼蜂和甘蓝夜蛾赤眼蜂线粒体细胞色素b（mtDNACytb）基因485bp序列,设计了4种赤眼蜂的特异PCR引物,以期用PCR方法对生物防治中4种重要的赤眼蜂进行快速、准确的鉴定,建立赤眼蜂快速的鉴定和检测技术。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试虫源
本研究中使用了桃园所采集的赤眼蜂。
采集时间：2015年5月2015年11月
采集周期：每周
采集地点：桃园
1.1.2主要实验仪器及试剂
PCR仪（MJ Resarch公司, PTC200） 凝胶成像系统(BioRad)
多功能电泳仪(BioRad) 温控水浴器（Memmert）
移液器（Gilson、Eppendorf） 恒温培养箱(GXZ型，宁波江南仪器厂)
电子天平(Sartorius) 显微镜和解剖镜（Leica MZ9.5，DMR）
恒温混匀器（Eppendorf Thermomix） 超低温冰箱（Thermo）
冰箱（Siemens） 离心机（Eppendorf）
全自动蒸气灭菌锅（Tomy SS3251） 制冰机（Sanyo SIMF124）
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