piggybac转座子在不同昆虫中剪切活性检测
本文利用显微注射的方法将Helper/Donor二元转化系统分别导入五种不同的昆虫胚胎中，24小时后重新从胚胎中抽提质粒DNA,并检测其剪切情况。结果表明piggyBac转座子在棉铃虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、大螟和玉米螟这五种昆虫卵中都能够进行精确的剪切，产生了预期大小的PCR条带。该结果证实虽然piggyBac转座子在棉铃虫中不能实现成功转化，但是该转座子却可以在棉铃虫胚胎中进行典型的piggyBac转座子的精确剪切。因此，piggyBac转座子在棉铃虫中转化的失败不是发生在剪切这一步，更有可能是DNA片段在转座插入新位点时受到了内源因子的抑制，或者是在转座成功之后有极大的不稳定因素使插入DNA片段重新被消除。本研究为进一步探究转座子的活性控制机理提供了初步的证据。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 实验材料 4
1.2 主要试剂和仪器设备 4
1.3 载体构建5
1.4 昆虫卵显微注射5
1.5 卵中质粒DNA的提取5
1.6 剪切实验5
1.7 常规分子克隆6
1.7.1 PCR回收与纯化6
1.7.2 连接转化6
1.7.3 连接产物的转化和挑取单克隆7
1.7.4 重组质粒提取及检测7
1.7.5 序列测定与分析7
2 结果与分析8
3 讨论8
致谢9
参考文献9
piggyBac转座子在不同昆虫中剪切活性检测
引言
转座子或转座元件（transposable element），是一种不依靠同源重组而能在基因组内移动(转座)的遗传学元件(DNA序列)。按照转座机制及序列特征可分为两大类：以RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的I型转座子即反转录转座子(retrotransposon或retroposon)和不以RNA为中介，直接通过转座酶发生转座的II型转座子(transposon)。转座子几乎存 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
在于所有真核生物基因组中，是真核生物基因组的重要组成部分。转座子通过影响真核生物基因组的大小和结构，基因组的遗传多样性，在宿主的进化过程中发挥重要作用。同时,转座子的自我复制和在宿主基因组中的移动能力使其成为重要的遗传学研究工具。
目前，根据II型转座子开发的转基因载体是转基因昆虫普遍采用的转化工具。这些II型转座子包括有：果蝇的P 因子，Tc1/Mariner家族的Minos，hAT家族的Hermes，Mariner家族的Mos1和piggyBac家族的IFP2。虽然上述转座子载体都能够实现转基因的目标，但是果蝇P因子在天然宿主以外的生物中没有活性（O’Brochta and Atkinson.,1996）； Tc1/Mariner 家族转座子的转座频率较低(Drabek et al, 2003)，携带外源基因的能力也有限(Ding et al, 2005)；Hermes因子在转化埃及伊蚊时发现旁侧不相关序列也被整合进入昆虫基因组(Sarkar et al, 1997)。只有piggyBac 家族的IFP2因子，不但能够在生物染色体中精确地剪切和转座，而且具有广泛的适用范围，在双翅目，鳞翅目，鞘翅目，同翅目和膜翅目五个目的几十种昆虫以及真涡虫，疟原虫，人和小鼠的哺乳动物细胞体内实现了高效地转化(Handler., 2002; Robinson, 2004; Allen, 2004; Shinmyo, 2004; Lobo et al., 2006; Wilson et al., 2007; Morales et al., 2007)。例如，丁昇等（2005）利用piggyBac转座子建立了高效小鼠基因插入突变及筛选技术，在不到一年内培育了数百个小鼠突变体，使得在小鼠等哺乳动物中高效、大规模研究基因功能成为可能。因此，piggyBac转座子成为目前最具有开发前景的载体之一(Xu et al，2006)。
尽管piggBac转座子在五个目的几十种昆虫中成功实现了转座,但是piggBac在草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda和棉铃虫Helibthis armigera Hiibner中始终没有获得成功转化的个体（ Zimowska and Handler, 2006）。据推测：可能是由于昆虫的某些内源类似因子阻遏了外源转基因载体的转座活性。然而，内源类似因子是如何抑制piggBac转座子转座活性的机理尚未有研究报道。DNA转座子的转座活性通常是有分为两个步骤：第一步是通过转座酶识别供体质粒上的特定位点，并加以剪切；第二步是将剪切下来的DNA片段特异性的插入特定位点。因此，本研究拟采用Helper/Donor二元转化系统，把编码转座酶的Helper质粒和提供剪切位点的Donor质粒通过显微注射的方法导入昆虫胚胎后，检测piggBac转座子在棉铃虫等难以获得转基因个体的昆虫中在第一步剪切上是否受到阻遏？本研究结果对于进一步探究转座子的活性控制机理具有十分重要的意义。
1 材料与方法
1．1 实验材料
实验中所选用的昆虫有大螟、棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和玉米螟。
1．2 主要试剂和仪器设备
主要试剂：
pGEMT easy载体、T4 DNA 连接酶；BglII限制性核酸内切酶； 其它常规试剂盒为，如OMEGA质粒提取试剂盒，OMEGA胶回收试剂盒和Qiagen公司的无内毒素质粒抽提试剂盒等。
主要仪器设备：
凝胶成像系统Gel Doc2000：美国BioRad公司；
超纯水系统E1IX10：美国Millipore公司；
Sorvall Legend Micro 21R离心机：美国Thermo Fisher公司；
离心机Centrifuge 5145D：德国Eppendorf 公司；
烘箱MC000712：德国MMM公司；
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 实验材料 4
1.2 主要试剂和仪器设备 4
1.3 载体构建5
1.4 昆虫卵显微注射5
1.5 卵中质粒DNA的提取5
1.6 剪切实验5
1.7 常规分子克隆6
1.7.1 PCR回收与纯化6
1.7.2 连接转化6
1.7.3 连接产物的转化和挑取单克隆7
1.7.4 重组质粒提取及检测7
1.7.5 序列测定与分析7
2 结果与分析8
3 讨论8
致谢9
参考文献9
piggyBac转座子在不同昆虫中剪切活性检测
引言
转座子或转座元件（transposable element），是一种不依靠同源重组而能在基因组内移动(转座)的遗传学元件(DNA序列)。按照转座机制及序列特征可分为两大类：以RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的I型转座子即反转录转座子(retrotransposon或retroposon)和不以RNA为中介，直接通过转座酶发生转座的II型转座子(transposon)。转座子几乎存 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
在于所有真核生物基因组中，是真核生物基因组的重要组成部分。转座子通过影响真核生物基因组的大小和结构，基因组的遗传多样性，在宿主的进化过程中发挥重要作用。同时,转座子的自我复制和在宿主基因组中的移动能力使其成为重要的遗传学研究工具。
目前，根据II型转座子开发的转基因载体是转基因昆虫普遍采用的转化工具。这些II型转座子包括有：果蝇的P 因子，Tc1/Mariner家族的Minos，hAT家族的Hermes，Mariner家族的Mos1和piggyBac家族的IFP2。虽然上述转座子载体都能够实现转基因的目标，但是果蝇P因子在天然宿主以外的生物中没有活性（O’Brochta and Atkinson.,1996）； Tc1/Mariner 家族转座子的转座频率较低(Drabek et al, 2003)，携带外源基因的能力也有限(Ding et al, 2005)；Hermes因子在转化埃及伊蚊时发现旁侧不相关序列也被整合进入昆虫基因组(Sarkar et al, 1997)。只有piggyBac 家族的IFP2因子，不但能够在生物染色体中精确地剪切和转座，而且具有广泛的适用范围，在双翅目，鳞翅目，鞘翅目，同翅目和膜翅目五个目的几十种昆虫以及真涡虫，疟原虫，人和小鼠的哺乳动物细胞体内实现了高效地转化(Handler., 2002; Robinson, 2004; Allen, 2004; Shinmyo, 2004; Lobo et al., 2006; Wilson et al., 2007; Morales et al., 2007)。例如，丁昇等（2005）利用piggyBac转座子建立了高效小鼠基因插入突变及筛选技术，在不到一年内培育了数百个小鼠突变体，使得在小鼠等哺乳动物中高效、大规模研究基因功能成为可能。因此，piggyBac转座子成为目前最具有开发前景的载体之一(Xu et al，2006)。
尽管piggBac转座子在五个目的几十种昆虫中成功实现了转座,但是piggBac在草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda和棉铃虫Helibthis armigera Hiibner中始终没有获得成功转化的个体（ Zimowska and Handler, 2006）。据推测：可能是由于昆虫的某些内源类似因子阻遏了外源转基因载体的转座活性。然而，内源类似因子是如何抑制piggBac转座子转座活性的机理尚未有研究报道。DNA转座子的转座活性通常是有分为两个步骤：第一步是通过转座酶识别供体质粒上的特定位点，并加以剪切；第二步是将剪切下来的DNA片段特异性的插入特定位点。因此，本研究拟采用Helper/Donor二元转化系统，把编码转座酶的Helper质粒和提供剪切位点的Donor质粒通过显微注射的方法导入昆虫胚胎后，检测piggBac转座子在棉铃虫等难以获得转基因个体的昆虫中在第一步剪切上是否受到阻遏？本研究结果对于进一步探究转座子的活性控制机理具有十分重要的意义。
1 材料与方法
1．1 实验材料
实验中所选用的昆虫有大螟、棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和玉米螟。
1．2 主要试剂和仪器设备
主要试剂：
pGEMT easy载体、T4 DNA 连接酶；BglII限制性核酸内切酶； 其它常规试剂盒为，如OMEGA质粒提取试剂盒，OMEGA胶回收试剂盒和Qiagen公司的无内毒素质粒抽提试剂盒等。
主要仪器设备：
凝胶成像系统Gel Doc2000：美国BioRad公司；
超纯水系统E1IX10：美国Millipore公司；
Sorvall Legend Micro 21R离心机：美国Thermo Fisher公司；
离心机Centrifuge 5145D：德国Eppendorf 公司；
烘箱MC000712：德国MMM公司；
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