免耕覆秸耕作制度下黄淮海大豆田土壤病原真菌的调查
中国是世界秸秆大国，秸秆资源的开发利用涉及到整个农业生态系统中的可持续发展问题。然而，秸秆还田也存在一些问题，如秸秆还田后难腐解，还田地块播种质量差、出苗率低，病虫害增加、作物生长缓慢甚至减产等。造成这些问题的原因尚不明确，但可能和土壤微生物相关。LAMP 检测技术是一种敏感的链取代核酸扩增技术，广泛应用于分子生物学检测，该方法较常规 PCR 具有特异性好、灵敏性高、检测时间短、判定结果简便以及无需使用昂贵仪器等优势。在过去几年实验室通过对黄淮海大豆根部主要病害的调查，建立了相应的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术体系。本实验通过以上建立的环介导等温扩增检测方法来调查免耕覆秸对黄淮海大豆田土壤病原真菌的影响。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法3
1.1 供试材料3
1.1.1 供试植株3
1.1.2 实验地点3
1.1.3 仪器与试剂3
1.2 试验方法3
1.2.1 免耕覆秸的田间设计准备3
1.2.2 土壤取样6
1.2.3 土壤真菌DNA提取6
1.2.4 LAMP检测土壤病原菌7
2 结果与分析8
2.1 土壤样品DNA LAMP检测结果及分析8
2.1.1 济宁地区LAMP检测结果8
2.1.2 徐州地区LAMP检测结果8
2.1.3 宿州地区LAMP检测结果8
2.2 植株样品DNA LAMP检测结果及分析9
3 讨论10
致谢11
参考文献12
免耕覆秸耕作制度下黄淮海大豆田土壤病原真菌的调查
引言
引言
世界农业发达国家十分重视土地的用养结合，秸秆还田就是其中受到大力支持的重要方式之一，在部分农业发达国家秸秆还田和农家肥占施肥总量的2/3[1]。美国把秸秆还田当作农作制中的一项关键技术，坚持常年实施玉米、小麦等秸秆大量还田，并 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
推广到了更大的领域。在丹麦的阿维多发电厂每年都会从农民手中购入约15万吨秸秆用来发电并将燃烧后的草木灰返还给农民用作肥料。英国秸秆直接还田量则占其生产量的73%[2]。日本和德国等发达国家法律规定禁止焚烧秸秆。在加拿大渥太华北部的农业区，玉米收割时收割机把玉米秆切碎，作为肥料直接还田。从世界各国在秸秆还田方面的研究和利用来看，秸秆还田措施在发展丰产、集约、优质、高效的农业生产中发挥了重要作用，已经受到世界各国的高度重视[3]。
我国农作物秸秆资源丰富，利用历史悠久。我国是农业大国，国土面积世界第三，耕种面积占世界的百分之十，自然也是秸秆资源最丰富的国家，毕于运和高春雨等人汇总出了中国各类秸秆的总产量和历年来全国秸秆总产量结果表明我国目前是世界第一秸秆产出大国，每年农作物秸秆产量在6亿吨以上，其总产量约占全球的1/5，比秸秆产量居全球第2位的美国高出约10%[4]。
秸秆中含有N、P、K大量养分元素及各种微量元素，还田后可为作物生长提供大量的营养元素，同时也可提高作物吸收养分的有效性。如果焚烧秸秆则造成氮、磷、硫等非金属元素全部损失，碳水化合物等有机物全部损失，燃烧后剩下的无机物主要成分是钾盐，不仅不利于改善土壤，而且会造成资源浪费[5]。秸秆还田后土壤中有机质、氮、磷等养分含量增加[6,7]，土壤微生物的土壤微生物量也有相应增加。微生物促进土壤养分元素的转化作用，所以微生物量的增加有益于作物的生长[8,9]。李洪文等人在稻秆覆盖不同处理的免耕试验中认为：虽然播种质量不如传统耕作，但由于提高了旱农区水分利用效率，免耕处理的玉米千粒重比传统耕作增加了39.46g，产量比传统耕作高511269kg/hm2，平均高594kg/hm2，增产率达到16%。短期内而言,稻秆覆盖于地表, 有保墒、稳温效果，可延缓作物根系衰老，作物生育期一般表现为延长。一般认为稻秆覆盖免耕改变了土壤的理化性质，使的土壤具有良好的孔隙状况，增加了雨水的入渗量，提高了土壤的含水量，增加了水分的储存，而且覆盖又抑制了水分的蒸发，故覆盖免耕具有较好的保水效果[10,11]。
尽管秸秆还田对于改善土壤理化性质、维持土壤生态环境以及提高作物产量等方面都有非常积极的作用[16]，但是若不能合理的对秸秆还田技术加以利用，往往也会造成一些负面的效果。随着秸秆还田面积的增大，秸秆还田存在的一些问题也随之出现。如秸秆还田后难腐解[17]，还田地块播种质量差、出苗率低，病虫害增加、作物生长缓慢甚至减产等。土壤作为农业生产中物质交换和能量转化的重要场所，在农业生态系统中处于核心地位；真菌作为土壤生态系统的重要组成部分是影响作物产量的重要因素之一，土壤真菌在生长发育过程中累积大量的菌丝体，使土壤的物理结构得到改善，也是参与土壤中有机质分解的主要成员之一，但真菌数量增加，也意味着病虫害加重，因为真菌容易引起一些土传病害的发生。麦角固醇为真菌细胞膜的重要成分，其含量高低与真菌群体大小密切相关。秸秆还田可提高土壤麦角固醇含量，秸秆耕前还田和播后还田土壤麦角固醇含量均高于对照。少耕有利于提高土壤微生物生物量，免耕、少耕和秸秆还田可增加土壤麦角固醇含量，即增大了土壤真菌群体[12]。研究表明，保护性耕作如长期免耕和秸秆还田有利于提高土壤微生物多样性，而传统耕作则减少了微生物多样性。Adl[14]等研究发现长期免耕（免耕425年）可以增加棉田土壤微生物多样性；CarpenterBoggs[15]等（至少6年）研究表明草地表层土壤的微生物土壤质量参数与耕作频度呈负相关。
近年来，随着分子生物学的飞速发展，推动了 PCR检测技术的不断成熟，为植物病原真菌的检测鉴定提供了新的方法和手段，植物真菌病害的诊断技术已从田间传统诊断、免疫学诊断发展到了以PCR为基础的植物病原菌的分子检测水平。迄今为止，植物真菌分子检测技术可大致归纳为以下几种：DNA探针检测技术（又称分子杂交技术）、基于PCR的病原菌的分子检测技术、基于Realtime PCR的病原菌的分子检测技术、环介导等温扩增技术和高通量检测技术[18]。
核酸诊断技术灵敏度高，特异性好，代表着体外诊断试剂的发展方向。但普通PCR检测因为特异性不够高而经常造成假阳性，因此如何尽量减少核酸扩增中的假阳性问题成为了研究的重点。实时荧光定量PCR有效的解决了这个问题，但设备以及试剂昂贵，对操作人员的技术要求较高，并不适合广大的基层工作单位使用。环介导等温扩增技术（loopmediated isothermal amplification，LAMP）作为一种新开发的核酸扩增技术， 60~65℃恒温扩增，30~80 min即可通过肉眼观察结果，具有操作简单、特异性强、灵敏度高、产物易检测等特点[18]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法3
1.1 供试材料3
1.1.1 供试植株3
1.1.2 实验地点3
1.1.3 仪器与试剂3
1.2 试验方法3
1.2.1 免耕覆秸的田间设计准备3
1.2.2 土壤取样6
1.2.3 土壤真菌DNA提取6
1.2.4 LAMP检测土壤病原菌7
2 结果与分析8
2.1 土壤样品DNA LAMP检测结果及分析8
2.1.1 济宁地区LAMP检测结果8
2.1.2 徐州地区LAMP检测结果8
2.1.3 宿州地区LAMP检测结果8
2.2 植株样品DNA LAMP检测结果及分析9
3 讨论10
致谢11
参考文献12
免耕覆秸耕作制度下黄淮海大豆田土壤病原真菌的调查
引言
引言
世界农业发达国家十分重视土地的用养结合，秸秆还田就是其中受到大力支持的重要方式之一，在部分农业发达国家秸秆还田和农家肥占施肥总量的2/3[1]。美国把秸秆还田当作农作制中的一项关键技术，坚持常年实施玉米、小麦等秸秆大量还田，并 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
推广到了更大的领域。在丹麦的阿维多发电厂每年都会从农民手中购入约15万吨秸秆用来发电并将燃烧后的草木灰返还给农民用作肥料。英国秸秆直接还田量则占其生产量的73%[2]。日本和德国等发达国家法律规定禁止焚烧秸秆。在加拿大渥太华北部的农业区，玉米收割时收割机把玉米秆切碎，作为肥料直接还田。从世界各国在秸秆还田方面的研究和利用来看，秸秆还田措施在发展丰产、集约、优质、高效的农业生产中发挥了重要作用，已经受到世界各国的高度重视[3]。
我国农作物秸秆资源丰富，利用历史悠久。我国是农业大国，国土面积世界第三，耕种面积占世界的百分之十，自然也是秸秆资源最丰富的国家，毕于运和高春雨等人汇总出了中国各类秸秆的总产量和历年来全国秸秆总产量结果表明我国目前是世界第一秸秆产出大国，每年农作物秸秆产量在6亿吨以上，其总产量约占全球的1/5，比秸秆产量居全球第2位的美国高出约10%[4]。
秸秆中含有N、P、K大量养分元素及各种微量元素，还田后可为作物生长提供大量的营养元素，同时也可提高作物吸收养分的有效性。如果焚烧秸秆则造成氮、磷、硫等非金属元素全部损失，碳水化合物等有机物全部损失，燃烧后剩下的无机物主要成分是钾盐，不仅不利于改善土壤，而且会造成资源浪费[5]。秸秆还田后土壤中有机质、氮、磷等养分含量增加[6,7]，土壤微生物的土壤微生物量也有相应增加。微生物促进土壤养分元素的转化作用，所以微生物量的增加有益于作物的生长[8,9]。李洪文等人在稻秆覆盖不同处理的免耕试验中认为：虽然播种质量不如传统耕作，但由于提高了旱农区水分利用效率，免耕处理的玉米千粒重比传统耕作增加了39.46g，产量比传统耕作高511269kg/hm2，平均高594kg/hm2，增产率达到16%。短期内而言,稻秆覆盖于地表, 有保墒、稳温效果，可延缓作物根系衰老，作物生育期一般表现为延长。一般认为稻秆覆盖免耕改变了土壤的理化性质，使的土壤具有良好的孔隙状况，增加了雨水的入渗量，提高了土壤的含水量，增加了水分的储存，而且覆盖又抑制了水分的蒸发，故覆盖免耕具有较好的保水效果[10,11]。
尽管秸秆还田对于改善土壤理化性质、维持土壤生态环境以及提高作物产量等方面都有非常积极的作用[16]，但是若不能合理的对秸秆还田技术加以利用，往往也会造成一些负面的效果。随着秸秆还田面积的增大，秸秆还田存在的一些问题也随之出现。如秸秆还田后难腐解[17]，还田地块播种质量差、出苗率低，病虫害增加、作物生长缓慢甚至减产等。土壤作为农业生产中物质交换和能量转化的重要场所，在农业生态系统中处于核心地位；真菌作为土壤生态系统的重要组成部分是影响作物产量的重要因素之一，土壤真菌在生长发育过程中累积大量的菌丝体，使土壤的物理结构得到改善，也是参与土壤中有机质分解的主要成员之一，但真菌数量增加，也意味着病虫害加重，因为真菌容易引起一些土传病害的发生。麦角固醇为真菌细胞膜的重要成分，其含量高低与真菌群体大小密切相关。秸秆还田可提高土壤麦角固醇含量，秸秆耕前还田和播后还田土壤麦角固醇含量均高于对照。少耕有利于提高土壤微生物生物量，免耕、少耕和秸秆还田可增加土壤麦角固醇含量，即增大了土壤真菌群体[12]。研究表明，保护性耕作如长期免耕和秸秆还田有利于提高土壤微生物多样性，而传统耕作则减少了微生物多样性。Adl[14]等研究发现长期免耕（免耕425年）可以增加棉田土壤微生物多样性；CarpenterBoggs[15]等（至少6年）研究表明草地表层土壤的微生物土壤质量参数与耕作频度呈负相关。
近年来，随着分子生物学的飞速发展，推动了 PCR检测技术的不断成熟，为植物病原真菌的检测鉴定提供了新的方法和手段，植物真菌病害的诊断技术已从田间传统诊断、免疫学诊断发展到了以PCR为基础的植物病原菌的分子检测水平。迄今为止，植物真菌分子检测技术可大致归纳为以下几种：DNA探针检测技术（又称分子杂交技术）、基于PCR的病原菌的分子检测技术、基于Realtime PCR的病原菌的分子检测技术、环介导等温扩增技术和高通量检测技术[18]。
核酸诊断技术灵敏度高，特异性好，代表着体外诊断试剂的发展方向。但普通PCR检测因为特异性不够高而经常造成假阳性，因此如何尽量减少核酸扩增中的假阳性问题成为了研究的重点。实时荧光定量PCR有效的解决了这个问题，但设备以及试剂昂贵，对操作人员的技术要求较高，并不适合广大的基层工作单位使用。环介导等温扩增技术（loopmediated isothermal amplification，LAMP）作为一种新开发的核酸扩增技术， 60~65℃恒温扩增，30~80 min即可通过肉眼观察结果，具有操作简单、特异性强、灵敏度高、产物易检测等特点[18]。
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