重测序技术研究水稻白叶枯病菌对噻枯唑的抗药性机制
本研究首次在基因水平研究水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo）对噻枯唑的抗药性机制。Xoo 2-1-1是野生型Xoo ZJ173接种喷施噻枯唑的水稻上筛选分离得到的对噻枯唑表现抗药性的菌株, 但2-1-1菌株在离体环境下表现对噻枯唑更加敏感。我们分别对ZJ173和2-1-1进行基因重测序技术研究，结果表明两种菌株均与标准菌株MAFF 311018 亲缘性最高，基因组匹配率为99.37%。通过分析抗药性菌株与药敏性菌株的序列差异中，单核苷酸多态性位（SNP）分析发现，ZJ173与2-1-1基因组之间有多处点突变，利用PCR测序技术对这些点突变进行了验证，筛选出了含点突变的Xoo 3738基因，再进行下一步研究。点突变的研究有利于药剂靶点的进一步筛选与确定。
目录
摘要.1
关键词.1
Abstract...1
Key words...1
引言.1
1材料与方法 2
1.1供试菌株 2
1.2培养条件 2
1.3实验仪器 2
2方法 2
2.1试剂盒提取ZJ173和211的基因组 2
2.2 ZJ173和211的重测序与分析 3
2.3 ZJ173和211的SNP、InDel和SV差异比较 3
2.4差异位点归类和验证 3
2.4.1 Xoo 3738基因的获取 3
2.4.2连接和转化 5
2.4.3重组菌株的获得 7
3结果与分析 7
3.1试剂盒提取ZJ173和211的基因组 7
3. 2 ZJ173和211的基因组的测序深度分析 8
3. 3 ZJ173和211的基因组与标准菌株的基因组比对结果 8
3. 4 ZJ173和211的基因组的测序深度在MAFF基因组上的分布 8
3. 5 ZJ173和211的基因组SNP差异统计 10
3. 6 SNP的验证 11
3. 7 ZJ173中Xoo 3738转化子的筛选 11
4总结 12
致谢 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
12
参考文献: 13
重测序技术研究水稻白叶枯病菌对噻枯唑的抗药性机制
引言
引言：药剂对病原物主要作用方式是结合内部靶标蛋白使得该蛋白功能丧失，导致病原物无法正常生长或增殖。一旦靶标位点突变，病原物则表现对药剂具有抗药性。本实验室研究的用于防治禾谷镰刀菌引起病害的氰烯菌酯就属于具有上述作用方式的药剂，点突变使得禾谷镰刀菌对氰烯菌酯产生高程度的抗药性。本实验室利用重测序技术将野生菌和抗性菌进行基因组序列比对，获得了一系列的基因点突变位点，后经过筛选验证成功地找到了肌球蛋白这一药剂的靶标位点[1]。
本实验室经过前期筛选已经成功获得了噻枯唑的抗药性菌株211，这为后续的靶标寻找工作提供了重要的实验材料[2]。但活体分离的抗性菌株211表现出离体条件下对噻枯唑更敏感[3]。本研究中我们利用重测序技术比对了Xoo ZJ173和Xoo 211的基因组序列，旨在通过点找出抗药性菌株与敏感菌株的基因变异，进而找出可能的药剂靶标。
1材料与方法
1.1供试菌株
水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）噻枯唑敏感性菌株ZJ173，本实验室经过前期筛选已经成功获得的噻枯唑抗药性菌株211[2]。
1.2培养条件
NB液体培养基（1 L）：
牛肉膏蛋白胨培养基（NB）1 L
牛肉浸膏
3 g
蛋白胨
5 g
酵母粉
1 g
蔗糖
10 g
加蒸馏水溶解后定容至1 L
将上述物质加入烧杯中，搅拌至完全溶解，用PH计调pH调至7.0~7.2，进行分装，之后在高温高压条件(121℃，110 kPa)下灭菌20 min。
NA固体培养基基本成分同上，每1000 mL液体培养基中加入20 g琼脂粉。
LB培养基（1L）
LB培养基1 L
多聚蛋白胨
10 g
酵母提取物
5 g
氯化钠
10 g
琼脂粉
20 g
加蒸馏水溶解后定容至1 L
定量称取上述物质于烧杯中，加超纯水至1000 ml, 用5mol/L NaOH（约0.2 ml）调pH至7.2，121℃灭菌20 min。
本研究所涉及的抗生素为卡那霉素（Kn）使用浓度为20 ppm。
Xoo菌株活化方法是：从原始菌株中蘸取少量菌体在NA培养基平板上划线分离培养出单菌落，在挑取单菌落于NB培养基中，放置于28℃摇床，175 rpm条件下，摇培2048小时。
1.3实验仪器
本实验所依托的植物保护学院植物药理学与病害防控实验室长期从事分子生物方面相关研究，具有DNA提取试剂盒、RNA纯化试剂盒、胶回收试剂盒等所需要的实验材料和PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、分光光度计、超低温冰箱、摇床、温箱、离心机、超净台等实验仪器。
2方法
2.1试剂盒提取ZJ173和211的基因组
使用从80℃保存的原始菌液，可以减少ZJ173和211菌株培养过程基因变异的可能，加入到NB中培养浓度达到108 CFU ml?1后，参考天根细菌基因组提取试剂盒提取ZJ173和211菌株的基因组，之后用无菌水溶解测定DNA浓度。步骤如下：
取细菌培养液15 ml，10 000 rpm离心1min，吸取上清。
向菌体沉淀中加入200 μl缓冲液GA，震荡至菌体悬浮。
目录
摘要.1
关键词.1
Abstract...1
Key words...1
引言.1
1材料与方法 2
1.1供试菌株 2
1.2培养条件 2
1.3实验仪器 2
2方法 2
2.1试剂盒提取ZJ173和211的基因组 2
2.2 ZJ173和211的重测序与分析 3
2.3 ZJ173和211的SNP、InDel和SV差异比较 3
2.4差异位点归类和验证 3
2.4.1 Xoo 3738基因的获取 3
2.4.2连接和转化 5
2.4.3重组菌株的获得 7
3结果与分析 7
3.1试剂盒提取ZJ173和211的基因组 7
3. 2 ZJ173和211的基因组的测序深度分析 8
3. 3 ZJ173和211的基因组与标准菌株的基因组比对结果 8
3. 4 ZJ173和211的基因组的测序深度在MAFF基因组上的分布 8
3. 5 ZJ173和211的基因组SNP差异统计 10
3. 6 SNP的验证 11
3. 7 ZJ173中Xoo 3738转化子的筛选 11
4总结 12
致谢 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
12
参考文献: 13
重测序技术研究水稻白叶枯病菌对噻枯唑的抗药性机制
引言
引言：药剂对病原物主要作用方式是结合内部靶标蛋白使得该蛋白功能丧失，导致病原物无法正常生长或增殖。一旦靶标位点突变，病原物则表现对药剂具有抗药性。本实验室研究的用于防治禾谷镰刀菌引起病害的氰烯菌酯就属于具有上述作用方式的药剂，点突变使得禾谷镰刀菌对氰烯菌酯产生高程度的抗药性。本实验室利用重测序技术将野生菌和抗性菌进行基因组序列比对，获得了一系列的基因点突变位点，后经过筛选验证成功地找到了肌球蛋白这一药剂的靶标位点[1]。
本实验室经过前期筛选已经成功获得了噻枯唑的抗药性菌株211，这为后续的靶标寻找工作提供了重要的实验材料[2]。但活体分离的抗性菌株211表现出离体条件下对噻枯唑更敏感[3]。本研究中我们利用重测序技术比对了Xoo ZJ173和Xoo 211的基因组序列，旨在通过点找出抗药性菌株与敏感菌株的基因变异，进而找出可能的药剂靶标。
1材料与方法
1.1供试菌株
水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）噻枯唑敏感性菌株ZJ173，本实验室经过前期筛选已经成功获得的噻枯唑抗药性菌株211[2]。
1.2培养条件
NB液体培养基（1 L）：
牛肉膏蛋白胨培养基（NB）1 L
牛肉浸膏
3 g
蛋白胨
5 g
酵母粉
1 g
蔗糖
10 g
加蒸馏水溶解后定容至1 L
将上述物质加入烧杯中，搅拌至完全溶解，用PH计调pH调至7.0~7.2，进行分装，之后在高温高压条件(121℃，110 kPa)下灭菌20 min。
NA固体培养基基本成分同上，每1000 mL液体培养基中加入20 g琼脂粉。
LB培养基（1L）
LB培养基1 L
多聚蛋白胨
10 g
酵母提取物
5 g
氯化钠
10 g
琼脂粉
20 g
加蒸馏水溶解后定容至1 L
定量称取上述物质于烧杯中，加超纯水至1000 ml, 用5mol/L NaOH（约0.2 ml）调pH至7.2，121℃灭菌20 min。
本研究所涉及的抗生素为卡那霉素（Kn）使用浓度为20 ppm。
Xoo菌株活化方法是：从原始菌株中蘸取少量菌体在NA培养基平板上划线分离培养出单菌落，在挑取单菌落于NB培养基中，放置于28℃摇床，175 rpm条件下，摇培2048小时。
1.3实验仪器
本实验所依托的植物保护学院植物药理学与病害防控实验室长期从事分子生物方面相关研究，具有DNA提取试剂盒、RNA纯化试剂盒、胶回收试剂盒等所需要的实验材料和PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、分光光度计、超低温冰箱、摇床、温箱、离心机、超净台等实验仪器。
2方法
2.1试剂盒提取ZJ173和211的基因组
使用从80℃保存的原始菌液，可以减少ZJ173和211菌株培养过程基因变异的可能，加入到NB中培养浓度达到108 CFU ml?1后，参考天根细菌基因组提取试剂盒提取ZJ173和211菌株的基因组，之后用无菌水溶解测定DNA浓度。步骤如下：
取细菌培养液15 ml，10 000 rpm离心1min，吸取上清。
向菌体沉淀中加入200 μl缓冲液GA，震荡至菌体悬浮。
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