胶状溶杆菌中第二信使cdigmp降解相关基因的克隆及敲除载体的构建
胶状溶杆菌（Lysobacter gummosus）属于黄单胞科(Xanthomonadaceae)，溶杆菌属(Lysobacter)，是一种重要的植物病害生防细菌。该菌能合成并分泌一些结构未知的小分子抗菌物质，抑制多种植物病原真菌的生长。环二鸟苷酸（c-di-GMP）是广泛存在于细菌中的一种第二信使，调控细菌多种重要的生理生化功能。本研究以实验室自主分离鉴定的胶状溶杆菌OH17菌株为对象，旨在探索c-di-GMP对该菌株抗菌物质合成及其抗菌活性的调控作用，主要侧重c-di-GMP降解相关蛋白（含EAL或HD-GYP结构域的蛋白负责c-di-GMP的降解）编码基因的克隆及敲除载体的构建。本研究从自主测序完成的OH17的全基因组鉴定了与c-di-GMP代谢相关的蛋白24个，包括11个可能参与c-di-GMP降解的蛋白，即含有EAL结构域的蛋白5个；含有HD-GYP结构域的蛋白6个。以这11个蛋白的编码基因为对象，通过PCR、酶切、连接等分子生物学技术，成功构建了11个敲除载体，为后续缺失每一个降解基因，研究其在胶状溶杆菌中的生物学功能奠定了重要基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法3
1.1实验所用菌株、质粒及其培养条件3
1.2引物设计3
1.3 培养基5
1.4 培养条件5
1.4.1 胶状溶杆菌OH17的培养与保存 5
1.4.2 大肠杆菌TOP10培养与保存 5
1.5 酶、抗生素、试剂盒和化学试剂5
1.6 实验器材6
1.7 实验原理6
1.7.1敲除载体构建策略6
1.7.2 同源重组原理 6
1.8 实验方法 7
1.8.1 胶状溶杆菌OH17基因组DNA提取7
1.8.2 TransTaq聚合酶PCR体系和反应条件 7
1.8.3 琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物 8
1.8.4 PCR产物纯化 8
1.8.5胶回收实验 8
1.8.6 酶 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
切体系 9
1.8.7 酶切产物的连接 9
1.8.8 连接产物转化大肠杆菌Top10 9
1.8.9重组载体的验证 10
1.8.10质粒的提取与双酶切验证 10
1.8.11 测序 11
2 结果与分析11
2.1 11个与cdiGMP降解相关的蛋白 11
2.2 构建获得重组载体12
2.3 重组载体验证13
3 讨论16
致谢16
参考文献17
胶状溶杆菌中第二信使cdiGMP降解相关基因的克隆及敲除载体的构建
引言
溶杆菌属（Lysobacter）属于变形杆菌门（Proteobacteria）、γ变形菌纲（Gmmaproteobaeteria）、黄单胞菌目（Xanthomonadaceae）、黄单胞科（Xanthomonadaeeae）。溶杆菌是一类具有滑移性、高G+C含量,对多种病原真菌、细菌和线虫有溶菌活性的革兰氏阴性杆菌[1]。这类细菌菌体呈杆状，两端钝圆，单生，大小一般为（0.20.5）μm×（270）μm[2]，无鞭毛，无芽孢、好氧性强，革兰氏染色阴性，最适生长温度为2540 ℃。大部分溶杆菌可以在TSA、NA 和LB培养基上生长，菌落呈奶油色、淡黄和黄色几种[3]。溶杆菌产生的大分子活性物质主要是一系列胞外酶，如α蛋白水解酶、几丁质酶、β1,3葡聚糖酶、核酶和磷酸酶等。溶杆菌合成的小分子活性物质主要为抗生素或其中间体，例如抗真菌因子HSAF、抗细菌活性产物WAP8294A2、Lysobactin、Cephabacins和 Tripropeptins等[1]。
胶状溶杆菌（L. gummosus）OH17是本实验室从安徽水稻根际土壤中分离筛选到的一株对丝状真菌、酵母和卵菌均具有拮抗活性的菌株，具有自主知识产权。目前，本课题组已经完成了该菌株的基因组测序，并从中鉴定了12个与次生代谢产物相关的基因簇。同时，课题组也建立了OH17的遗传操作体系，实现了基因的定向敲除和互补。利用该操作体系，课题组正在研究这些基因簇的生物学功能期望从中发现与抗菌活性以及小分子抗菌物质的生物合成相关的基因簇。
与此同时，本课题组还期望利用基因遗传调控的手段来获得抗菌活性丧失或显著下降的突变株。通过对野生型OH17和这些突变株代谢产物的化学分析，快速定位与抗菌活性相关的小分子代谢物质，进而研究它们在OH17中的生物合成机理。本人的毕业实习课题就是围绕该总体目标来设计和开展相关实验的。具体来说，本人的研究目标是探索细菌新型第二信使环二鸟苷酸（cdiGMP）在胶状溶杆菌OH17抗菌活性发挥中的功能，主要聚焦OH17中cdiGMP降解相关基因的克隆及敲除载体的构建。
cdiGMP是细菌中一种广泛的核酸类第二信使，调控细菌的多种重要生理生化功能[10]。 cdiGMP在细菌体内的浓度受到严格调控。含有GGDEF 结构域的蛋白被证实具有鸟苷酸环化酶（DGC）活性，能将两分子GTP连接合成 cdiGMP；而含有EAL或者HDGYP 结构域的蛋白具有磷酸二酯酶（PDE）的活性，能将cdiGMP降解为GMP或中间产物pGpG。另外，还有一类蛋白同时含有GGDEF和EAL结构域，这类蛋白通常其中一个结构域发生突变而丧失酶活性，只发挥另外一个结构域的功能，如马铃薯软腐病菌Dickeya dadantii中的EcpB，其GGDEF活性中心被突变为RSSGV，该蛋白主要表现出EAL结构域的PDE活性[4]。
cdiGMP调控细菌的各种生命活动主要表现在以下几个方面。在运动性方面，cdiGMP可以调控细菌的各种运动方式包括单细胞游动(swimming)、多细胞群集(swarming)和蹭动(twitching)等；生物膜形成方面，低浓度 cdiGMP 抑制生物膜形成和表面附着物质产生，使细菌处于游动状态。而高浓度cdiGMP 提高黏附基质成分表达，产生多细胞行为，促进生物膜形成 [5]；胞外多糖（EPS）合成方面，细胞内cdiGMP含量升高可以促进EPS的产生，而 EPS 的增加会促进生物膜的形成。此外，cdiGMP还能调控细菌毒性因子的产生[6]，三型分泌系统 ( type III secretion system, T3SS) 基因的表达，影响病原细菌致病性，cdiGMP 对细菌生物膜形成、运动性、多糖合成、胞外酶的分泌以及三型分泌系统的调控，往往是相互联系并共同影响到细菌的致病性[7]。cdiGMP在细菌体内调控众多的细胞行为是由于细菌体内有不同种类的受体能感知cdiGMP 的浓度变化，从而启动下游特定基因表达或信号转导。这些受体包括退化的 GGDEF或者 EAL 结构域蛋白，多种不同的转录因子，PilZ结构域蛋白和核糖开关等。
综上，过去对cdiGMP的研究多数集中在植物和动物病原细菌中，但在生防细菌中，cdiGMP信号途径在抗菌活性和小分子抗菌物质生物合成方面的研究很少有报道，特别是在溶杆菌中，cdiGMP的相关研究还未报道[8]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法3
1.1实验所用菌株、质粒及其培养条件3
1.2引物设计3
1.3 培养基5
1.4 培养条件5
1.4.1 胶状溶杆菌OH17的培养与保存 5
1.4.2 大肠杆菌TOP10培养与保存 5
1.5 酶、抗生素、试剂盒和化学试剂5
1.6 实验器材6
1.7 实验原理6
1.7.1敲除载体构建策略6
1.7.2 同源重组原理 6
1.8 实验方法 7
1.8.1 胶状溶杆菌OH17基因组DNA提取7
1.8.2 TransTaq聚合酶PCR体系和反应条件 7
1.8.3 琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物 8
1.8.4 PCR产物纯化 8
1.8.5胶回收实验 8
1.8.6 酶 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
切体系 9
1.8.7 酶切产物的连接 9
1.8.8 连接产物转化大肠杆菌Top10 9
1.8.9重组载体的验证 10
1.8.10质粒的提取与双酶切验证 10
1.8.11 测序 11
2 结果与分析11
2.1 11个与cdiGMP降解相关的蛋白 11
2.2 构建获得重组载体12
2.3 重组载体验证13
3 讨论16
致谢16
参考文献17
胶状溶杆菌中第二信使cdiGMP降解相关基因的克隆及敲除载体的构建
引言
溶杆菌属（Lysobacter）属于变形杆菌门（Proteobacteria）、γ变形菌纲（Gmmaproteobaeteria）、黄单胞菌目（Xanthomonadaceae）、黄单胞科（Xanthomonadaeeae）。溶杆菌是一类具有滑移性、高G+C含量,对多种病原真菌、细菌和线虫有溶菌活性的革兰氏阴性杆菌[1]。这类细菌菌体呈杆状，两端钝圆，单生，大小一般为（0.20.5）μm×（270）μm[2]，无鞭毛，无芽孢、好氧性强，革兰氏染色阴性，最适生长温度为2540 ℃。大部分溶杆菌可以在TSA、NA 和LB培养基上生长，菌落呈奶油色、淡黄和黄色几种[3]。溶杆菌产生的大分子活性物质主要是一系列胞外酶，如α蛋白水解酶、几丁质酶、β1,3葡聚糖酶、核酶和磷酸酶等。溶杆菌合成的小分子活性物质主要为抗生素或其中间体，例如抗真菌因子HSAF、抗细菌活性产物WAP8294A2、Lysobactin、Cephabacins和 Tripropeptins等[1]。
胶状溶杆菌（L. gummosus）OH17是本实验室从安徽水稻根际土壤中分离筛选到的一株对丝状真菌、酵母和卵菌均具有拮抗活性的菌株，具有自主知识产权。目前，本课题组已经完成了该菌株的基因组测序，并从中鉴定了12个与次生代谢产物相关的基因簇。同时，课题组也建立了OH17的遗传操作体系，实现了基因的定向敲除和互补。利用该操作体系，课题组正在研究这些基因簇的生物学功能期望从中发现与抗菌活性以及小分子抗菌物质的生物合成相关的基因簇。
与此同时，本课题组还期望利用基因遗传调控的手段来获得抗菌活性丧失或显著下降的突变株。通过对野生型OH17和这些突变株代谢产物的化学分析，快速定位与抗菌活性相关的小分子代谢物质，进而研究它们在OH17中的生物合成机理。本人的毕业实习课题就是围绕该总体目标来设计和开展相关实验的。具体来说，本人的研究目标是探索细菌新型第二信使环二鸟苷酸（cdiGMP）在胶状溶杆菌OH17抗菌活性发挥中的功能，主要聚焦OH17中cdiGMP降解相关基因的克隆及敲除载体的构建。
cdiGMP是细菌中一种广泛的核酸类第二信使，调控细菌的多种重要生理生化功能[10]。 cdiGMP在细菌体内的浓度受到严格调控。含有GGDEF 结构域的蛋白被证实具有鸟苷酸环化酶（DGC）活性，能将两分子GTP连接合成 cdiGMP；而含有EAL或者HDGYP 结构域的蛋白具有磷酸二酯酶（PDE）的活性，能将cdiGMP降解为GMP或中间产物pGpG。另外，还有一类蛋白同时含有GGDEF和EAL结构域，这类蛋白通常其中一个结构域发生突变而丧失酶活性，只发挥另外一个结构域的功能，如马铃薯软腐病菌Dickeya dadantii中的EcpB，其GGDEF活性中心被突变为RSSGV，该蛋白主要表现出EAL结构域的PDE活性[4]。
cdiGMP调控细菌的各种生命活动主要表现在以下几个方面。在运动性方面，cdiGMP可以调控细菌的各种运动方式包括单细胞游动(swimming)、多细胞群集(swarming)和蹭动(twitching)等；生物膜形成方面，低浓度 cdiGMP 抑制生物膜形成和表面附着物质产生，使细菌处于游动状态。而高浓度cdiGMP 提高黏附基质成分表达，产生多细胞行为，促进生物膜形成 [5]；胞外多糖（EPS）合成方面，细胞内cdiGMP含量升高可以促进EPS的产生，而 EPS 的增加会促进生物膜的形成。此外，cdiGMP还能调控细菌毒性因子的产生[6]，三型分泌系统 ( type III secretion system, T3SS) 基因的表达，影响病原细菌致病性，cdiGMP 对细菌生物膜形成、运动性、多糖合成、胞外酶的分泌以及三型分泌系统的调控，往往是相互联系并共同影响到细菌的致病性[7]。cdiGMP在细菌体内调控众多的细胞行为是由于细菌体内有不同种类的受体能感知cdiGMP 的浓度变化，从而启动下游特定基因表达或信号转导。这些受体包括退化的 GGDEF或者 EAL 结构域蛋白，多种不同的转录因子，PilZ结构域蛋白和核糖开关等。
综上，过去对cdiGMP的研究多数集中在植物和动物病原细菌中，但在生防细菌中，cdiGMP信号途径在抗菌活性和小分子抗菌物质生物合成方面的研究很少有报道，特别是在溶杆菌中，cdiGMP的相关研究还未报道[8]。
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