田间小菜蛾茚虫威抗性相关突变频率检测
摘要：小菜蛾是世界性分布的重要农业害虫，由于其生殖周期短，繁殖量大和田间广泛存在的选择压力，使之成为十字花科蔬菜的最主要的害虫之一。茚虫威第一个商品化的钠离子通道阻断型杀虫剂，具有独特的作用机制，对鳞翅目害虫具有卓越的杀虫活性。本文调查了我国田间小菜蛾种群对茚虫威的抗性现状，发现华东和华南地区的抗性水平介于3.3-896.6倍之间；检测了与茚虫威抗性相关的钠离子通道等位基因突变频率，田间个体的等位基因突变频率为0.02-0.63。本研究发现茚虫威抗性水平存在区域性差异，进一步证实田间抗性与实验室已报道的基因突变频率存在显著相关性。相关研究有助于开展田间小菜蛾茚虫威抗性的快速筛查，并为其他害虫茚虫威靶标抗性的分子机理提供了借鉴。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1供试虫源2
1.1.2供试药剂及试剂2
1.2方法 2
1.2.1小菜蛾的饲养2
1.2.2小菜蛾对茚虫威的生物测定2
1.2.3基因组DNA的制备3
1.2.4 PCR反应3
1.2.5 PCR产物的纯化回收4
2结果与分析4
2.1田间茚虫威抗性监测4
2.2茚虫威抗性相关突变基因频率检测5
2.3钠离子通道突变检测技术6
3讨论 7
3.1小菜蛾田间种群对茚虫威的抗性7
3.2小菜蛾对茚虫威的代谢抗性7
3.3小菜蛾对茚虫威的靶标抗性8
致谢8
参考文献9
田间小菜蛾茚虫威抗性相关突变频率检测
引言
引言
小菜蛾是为害十字花科的重要害虫之一，在全世界范围内的许多国家都出现了对杀虫剂产生抗药性的报道。小菜蛾由于其年发生的世代多，繁殖率高，世代间虫口数量增长快，世代重叠现象严重，导致防治的困难较高，出现了频繁滥用杀虫剂以及对许多杀虫剂的广泛交互抗性和多重耐药性的现象。目前，关于小菜蛾产生的抗药性的机理研究，主要包括与
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
抗性代谢有关的酶的代谢能力增强、表皮穿透作用降低、靶标部位的敏感性降低等几个方面（宋深伟等，2007）。
茚虫威是一种新型的噁二嗪类杀虫剂，具有结构新、作用机理独特和使用量低的特点，几乎对于所有鳞翅目类的害虫都有效果然而对于人类、环境、作物和非靶标生物都是十分安全等特点。茚虫威作为钠离子通道阻断型杀虫剂可以在昆虫的体内迅速转化为更有效抑制电压门控钠通道的N去甲氧羰基代谢物（DCJW）。茚虫威对鳞翅类昆虫表现出更强的杀虫活性。
自茚虫威问世以来，田间的昆虫种群和室内的选育品种都对该杀虫剂产生了不同程度的抗药性。Sayyed和Wright（2006）在马来西亚金马伦高原地区釆集了小菜蛾田间种群，室内繁殖2代后进行茚虫威抗药性测定。结果显示该地区小菜蛾田间种群对茚虫威的抗性达到高水平抗药性，抗性倍数为813。而后在没有任何药剂选择压力下饲养8代，发现抗性倍数下降至29。Atuinurirava等（2010）于2008年从斐济新加东加河谷地区商业化甘蓝基地采集试虫并进行了抗药性监测。结果表明，该地区四个田间种群(SIGA、SUV、SMV、SLV)对茚虫威均产生了中等水平抗药性，抗性倍数分别为56、86、40、89。尹艳琼等（2013）用浸叶法监测了云南陆良菜区小菜蛾田间种群对茚虫威的抗药性。结果显示，2009年秋季、2010年春季的LC50值分别为23.97 mg/L和13.83 mg/L，与敏感种群相比，其抗性倍数分别为46.10和26.59，均达到中等水平抗药性。王士军等（2011）在室内测定了张家口地区田间小菜蛾种群对茚虫威的毒力，结果表明，该药剂对小菜蛾的LC50仅为0.138mg/L，与室内敏感品系相比，抗性倍数仅为0.02，表明该地区小菜蛾田间种群对茚虫威没有产生抗药性，依然可以作为主要防治药剂使用。
鉴于小菜蛾种群已经对杀虫剂茚虫威产生了不同程度的抗药性，所以在研究茚虫威的抗性分子机理不仅有助于解析靶基因变异所致的杀虫剂抗性进化机制，同时对田间合理科学使用钠离子通道阻断剂类的药剂具有重要意义。本文在昆虫分子毒理实验室前期研究已经明确小菜蛾钠离子通道突变与茚虫威抗性相关的基础上，开展了田间种群对茚虫威抗性的调查和抗性相关突变基因的分子检测工作。该研究检测到田间种群对茚虫威进化的抗性具有区域性特征，并进一步明确了钠离子通道基因F1845Y和V1848I突变与茚虫威抗性的相关性。本文使用的分子检测技术可有效应用于田间抗性的快速检测，为小菜蛾抗性检测和治理提供了重要参考依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试虫源
56月份从南京、昆山、合肥、济南、增城、白云、惠州、深圳各个监测点采集的小菜蛾。室内的敏感品系Roth，是由英国的洛桑实验站惠赠，在室内并不接触任何类型的药剂环境中饲养了20年以上。
1．1．2 供试药剂及试剂
5% EC茚虫威、RNase A、Buffer CL、Proteinase K、Buffer PK、Buffer PD、Buffer W1、Buffer W2 concentrate、Eluent、GC Buffer I、dNTP mixture、F2g、R2g、Taq DNA 聚合酶、ddH2O、Buffer DEA、Buffer DEB
1．2 方法
1．2．1小菜蛾的饲养
室内小菜蛾的饲养方法参照蛭石萝卜苗法（陈之浩等，1990）。饲养条件：温度25士1℃，相对湿度70%，光照比（L:D）为16:8。
1．2．2小菜蛾对茚虫威的生物测定
参照的是Shelton等（1993）的浸叶法。取用的是洁净甘蓝（Brassica oleracea）的叶片，切割成为直径6.5cm的圆片（不含叶子的主叶脉）。设置10ppm、3ppm、1ppm、0.3ppm、0.1ppm几个药剂的浓度，并且以清水（含0.5‰ TrionX100）做空白的对照。每个浓度进行4次重复，每个重复处理10头的3龄中期的试虫。将叶片在药液中浸泡了10秒后取出，把晾干的叶片垫在培养皿中，每个重复处理10头3龄中期的试虫，覆盖双层的吸水纸后盖上培养皿的上盖，并且用标签注明药剂的名称和浓度，倒置于培养箱中。处理后的试虫的饲养条件是：温度为25±1℃，相对湿度为6070%，光照比为（L：D）16: 8。数据分析则采用的是PoLo Plus软件计算毒力回归方程的斜率（slope）、标准误、LC50 值及其95%置信区间。抗性分级标准是：110倍为低水平抗性，10100为中水平抗性，100以上为高水平抗性。
1.2.3基因组DNA的制备
采用的是AXYPREPTM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit的基因组试剂盒说明书，分别对不同浓度茚虫威处理的种群单头提取小菜蛾幼虫（每头约78mg）基因组DNA。
取整头小菜蛾幼虫，移入冰水浴预冷的研钵中，快速、用力的研磨成匀浆；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1供试虫源2
1.1.2供试药剂及试剂2
1.2方法 2
1.2.1小菜蛾的饲养2
1.2.2小菜蛾对茚虫威的生物测定2
1.2.3基因组DNA的制备3
1.2.4 PCR反应3
1.2.5 PCR产物的纯化回收4
2结果与分析4
2.1田间茚虫威抗性监测4
2.2茚虫威抗性相关突变基因频率检测5
2.3钠离子通道突变检测技术6
3讨论 7
3.1小菜蛾田间种群对茚虫威的抗性7
3.2小菜蛾对茚虫威的代谢抗性7
3.3小菜蛾对茚虫威的靶标抗性8
致谢8
参考文献9
田间小菜蛾茚虫威抗性相关突变频率检测
引言
引言
小菜蛾是为害十字花科的重要害虫之一，在全世界范围内的许多国家都出现了对杀虫剂产生抗药性的报道。小菜蛾由于其年发生的世代多，繁殖率高，世代间虫口数量增长快，世代重叠现象严重，导致防治的困难较高，出现了频繁滥用杀虫剂以及对许多杀虫剂的广泛交互抗性和多重耐药性的现象。目前，关于小菜蛾产生的抗药性的机理研究，主要包括与
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
抗性代谢有关的酶的代谢能力增强、表皮穿透作用降低、靶标部位的敏感性降低等几个方面（宋深伟等，2007）。
茚虫威是一种新型的噁二嗪类杀虫剂，具有结构新、作用机理独特和使用量低的特点，几乎对于所有鳞翅目类的害虫都有效果然而对于人类、环境、作物和非靶标生物都是十分安全等特点。茚虫威作为钠离子通道阻断型杀虫剂可以在昆虫的体内迅速转化为更有效抑制电压门控钠通道的N去甲氧羰基代谢物（DCJW）。茚虫威对鳞翅类昆虫表现出更强的杀虫活性。
自茚虫威问世以来，田间的昆虫种群和室内的选育品种都对该杀虫剂产生了不同程度的抗药性。Sayyed和Wright（2006）在马来西亚金马伦高原地区釆集了小菜蛾田间种群，室内繁殖2代后进行茚虫威抗药性测定。结果显示该地区小菜蛾田间种群对茚虫威的抗性达到高水平抗药性，抗性倍数为813。而后在没有任何药剂选择压力下饲养8代，发现抗性倍数下降至29。Atuinurirava等（2010）于2008年从斐济新加东加河谷地区商业化甘蓝基地采集试虫并进行了抗药性监测。结果表明，该地区四个田间种群(SIGA、SUV、SMV、SLV)对茚虫威均产生了中等水平抗药性，抗性倍数分别为56、86、40、89。尹艳琼等（2013）用浸叶法监测了云南陆良菜区小菜蛾田间种群对茚虫威的抗药性。结果显示，2009年秋季、2010年春季的LC50值分别为23.97 mg/L和13.83 mg/L，与敏感种群相比，其抗性倍数分别为46.10和26.59，均达到中等水平抗药性。王士军等（2011）在室内测定了张家口地区田间小菜蛾种群对茚虫威的毒力，结果表明，该药剂对小菜蛾的LC50仅为0.138mg/L，与室内敏感品系相比，抗性倍数仅为0.02，表明该地区小菜蛾田间种群对茚虫威没有产生抗药性，依然可以作为主要防治药剂使用。
鉴于小菜蛾种群已经对杀虫剂茚虫威产生了不同程度的抗药性，所以在研究茚虫威的抗性分子机理不仅有助于解析靶基因变异所致的杀虫剂抗性进化机制，同时对田间合理科学使用钠离子通道阻断剂类的药剂具有重要意义。本文在昆虫分子毒理实验室前期研究已经明确小菜蛾钠离子通道突变与茚虫威抗性相关的基础上，开展了田间种群对茚虫威抗性的调查和抗性相关突变基因的分子检测工作。该研究检测到田间种群对茚虫威进化的抗性具有区域性特征，并进一步明确了钠离子通道基因F1845Y和V1848I突变与茚虫威抗性的相关性。本文使用的分子检测技术可有效应用于田间抗性的快速检测，为小菜蛾抗性检测和治理提供了重要参考依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试虫源
56月份从南京、昆山、合肥、济南、增城、白云、惠州、深圳各个监测点采集的小菜蛾。室内的敏感品系Roth，是由英国的洛桑实验站惠赠，在室内并不接触任何类型的药剂环境中饲养了20年以上。
1．1．2 供试药剂及试剂
5% EC茚虫威、RNase A、Buffer CL、Proteinase K、Buffer PK、Buffer PD、Buffer W1、Buffer W2 concentrate、Eluent、GC Buffer I、dNTP mixture、F2g、R2g、Taq DNA 聚合酶、ddH2O、Buffer DEA、Buffer DEB
1．2 方法
1．2．1小菜蛾的饲养
室内小菜蛾的饲养方法参照蛭石萝卜苗法（陈之浩等，1990）。饲养条件：温度25士1℃，相对湿度70%，光照比（L:D）为16:8。
1．2．2小菜蛾对茚虫威的生物测定
参照的是Shelton等（1993）的浸叶法。取用的是洁净甘蓝（Brassica oleracea）的叶片，切割成为直径6.5cm的圆片（不含叶子的主叶脉）。设置10ppm、3ppm、1ppm、0.3ppm、0.1ppm几个药剂的浓度，并且以清水（含0.5‰ TrionX100）做空白的对照。每个浓度进行4次重复，每个重复处理10头的3龄中期的试虫。将叶片在药液中浸泡了10秒后取出，把晾干的叶片垫在培养皿中，每个重复处理10头3龄中期的试虫，覆盖双层的吸水纸后盖上培养皿的上盖，并且用标签注明药剂的名称和浓度，倒置于培养箱中。处理后的试虫的饲养条件是：温度为25±1℃，相对湿度为6070%，光照比为（L：D）16: 8。数据分析则采用的是PoLo Plus软件计算毒力回归方程的斜率（slope）、标准误、LC50 值及其95%置信区间。抗性分级标准是：110倍为低水平抗性，10100为中水平抗性，100以上为高水平抗性。
1.2.3基因组DNA的制备
采用的是AXYPREPTM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit的基因组试剂盒说明书，分别对不同浓度茚虫威处理的种群单头提取小菜蛾幼虫（每头约78mg）基因组DNA。
取整头小菜蛾幼虫，移入冰水浴预冷的研钵中，快速、用力的研磨成匀浆；
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