棉花全基因组水通道蛋白家族基因发掘与表达分析
水通道蛋白可在细胞膜上高效选择性转运水和其它小分子物质，在生物抗逆进程中扮演重要角色。目前关于棉花中水通道蛋白家族的研究鲜有报道。本研究中，我们从三个测序的棉种, 陆地棉（G. hirsutum）,雷蒙德氏棉（G. raimondii）,亚洲棉（G. arboreum）种中分别鉴定得到水通道蛋白序列116条、58条、和57条。根据棉花水通道蛋白间进化关系，水通道蛋白家族（MIP）又可细分为5个亚族PIP、TIP、NIP、SIP和XIP。保守序列分析显示所有水通道蛋白序列均包含典型水通道蛋白结构域。基因结构分析显示大多数水通道蛋白含有2-6个外显子，而每个亚族都有高度精确的外显子数目和长度。基于戴维逊氏棉盐胁迫前后根部和叶部的表达分析，发现在根部表达的水通道蛋白基因显著多于其在叶部表达，且在根部的平均表达量更高。盐胁迫下，水通道蛋白基因在戴维逊氏棉不同组织表达特征显示为多数水通道蛋白基因在根部下调表达。且根部和叶部可能存在不同表达调控机制。综上，本研究鉴定出一些具有优良组织特异性和盐胁迫应答的水通道蛋白候选基因，对棉花抗逆遗传及育种研究提供参考。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1蛋白和核酸序列2
1.2棉花MIP家族鉴定2
1.3棉花MIP家族系统发育分析3
1.4棉花水通道蛋白理化性质及结构分析3
1.5棉花水通道蛋白表达分析3
2结果与分析3
2.1棉花水通道蛋白鉴定3
2.2水通道蛋白系统发育分析4
2.3棉花水通道蛋白基因结构分析5
2.4棉花水通道蛋白保守序列分析6
2.5棉花水通道蛋白理化特性7
2.6棉花水通道蛋白表达分析8
2.7棉花水通道蛋白盐胁迫应答表达分析9
3讨论10
致谢11
参考文献11
棉花全基因组水通道蛋白家族基因发掘与表达分析
引言
水通道蛋白（aquaporin，AQP）是一类膜通道蛋白，在细胞膜上高效选择性转运水
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
分子和其他物质（CO2、甘油、硼酸），与离子通道、甘油通道等功能通道蛋白同属MIP（major intrinsic protein）蛋白家族，分子质量在23—31 ka[1]。水通道蛋白普遍存在于细菌、真菌、动物和植物体内[2]。在高等植物中，根据水通道蛋白的亚细胞定位，并结合水通道蛋白氨基酸序列同源性[3]，水通道蛋白又分为5个亚家族，分别是质膜膜内蛋白（PIP）[4]，液泡膜膜内蛋白（TIP）[5]，NOD26根瘤共生膜内蛋白（NIP）[6]，小碱性膜内蛋白（SIP）[7]，以及最近报道发现的X膜内蛋白（XIP）。目前已在原生动物、真菌和某些陆地植物中发现XIP的存在，例如毛果杨、烟草、番茄和马铃薯[8]。
植物水通道蛋白的结构高度保守，通道蛋白的一级结构含有6个α螺旋的跨膜区域(TM 1TM 6)，氨基酸链在膜两侧形成5个环(loop，AE) [9]，B环和E环包含高度保守的AsnProAla (NPA) 氨基酸组，是选择透过性水通道的重要组成部分。水通道蛋白序列的其他重要氨基酸残基是芳香族或精氨酸选择透过结构的组成部分。四个残基构成的这个区域（ar/R）从NPA区到细胞外侧的长度大约为8?。这四个残基是由helix2 (H2)、helix 5 (H5)、和loop E (LE1和LE2)提供[10]。该区域（ar/R）被认为是充当底物转运的一个选择性透过结构，是通过充当分子体积排阻来决定蛋白转运速率，也为输送的溶质分子和水分子提供关键的氢键和范德华力[11]。
植物生长发育过程中，水通道蛋白有效地促进了水分子快速跨膜运输，例如种子萌发、细胞伸长、气孔运动、韧皮部装载与卸载以及生殖生长。生理生化证据显示，一种公认的质膜水通道蛋白磷酸化导致水通道的激活以及调节郁金香花瓣温控开放[12]。另一研究表明，RcPIP2.1的表达与黄化下胚轴的伸长运动相关，以及该下胚轴伸长区表现出高水分传导性[13]。此外，遗传学分析同样揭示出水通道蛋白在植物生长发育过程中扮演着重要的角色。据报道，GhPIP2蛋白合成异聚体促进棉花纤维的快速伸长[14]。这些研究都论证了植物生长发育过程中水通道蛋白介导水分的跨膜转运。
大量研究已经表明，非生物胁迫（干旱、盐碱和冷害）能够诱导水通道蛋白转录积累，进一步遗传学分析证实水通道蛋白对植物抗逆起重要作用[15]。经干旱处理和盐处理，TaAQP7和TaAQP8显示出分别被诱导表达，而烟草中TaAQP7和TaAQP8的过量表达被发现是用来分别提高对干旱胁迫和盐胁迫的抵抗力[16]。MusaPIP1.2过表达的香蕉植株表现出对干旱胁迫、盐胁迫和冷害胁迫抵抗力的提高。香蕉MusaPIP1.2在拟南芥中的异源表达显示水通道蛋白通过减少膜损伤，改善膜内外离子分布和维持渗透平衡来提高对逆境的耐受力[17]。最近研究表明，MusaPIP1.2在香蕉中的常规和逆境诱导过表达都会导致植株对盐胁迫耐受力的提高[18]。总之，诸多证据表明水通道蛋白在植物非生物胁迫应答机制中具有积极意义。
全基因组分析已经在拟南芥中发掘出35条水通道蛋白[3]，水稻中有33条[19]，玉米中有36条[7]以及大白菜中有53条[20]。尽管近年来关于植物水通道蛋白研究不断，但AQP相关研究在棉花上鲜有报道。棉花是全球重要的经济作物之一，也是天然纤维的主要原料，全世界超过30个国家进行种植，在农业及国民生产中占据着重要的地位。棉花纤维产量和品质主要影响因素是水，促进水分子通过棉花细胞膜的物质是水通道蛋白。棉花全基因组测序的完成，使我们能够对棉花基因进行全基因组分析。棉花水通道蛋白家族的基因发掘和表达分析对未来研究棉花纤维的品质改良和抗逆提供了有利的条件。
1 材料与方法
1．1 植物蛋白和核酸序列来源
雷蒙德氏棉（G. raimondii），亚洲棉（G. arboreum）和陆地棉（G. hirsutum）三个棉种的全基因组序列及其注释分别从http://www.phytozome.net/, http://cgp.genomics.org.cn 和http://mascotton.njau.edu.cn/ 网站下载获得。拟南芥水通道蛋白数据来自TAIR:（http://www.arabidopsis.org）数据库。用于预测水通道蛋白结构域的种子文件PF00230，从Pfam (http://pfam.xfam.org/)下载获得。盐胁迫下戴维逊氏棉（G.davidsonii）的表达数据来自于NCBI SRA数据，数据登录号为SRP061663。
1．2 棉花MIP家族鉴定
使用三个棉种的所有被注释的蛋白 和拟南芥中已经鉴定的MIP家族进行同源比对，以e<1010为阈值，筛选获得可靠的比对结果。同时使用hmmer对三个棉种中的蛋白进行结构域的搜索(以PF00230为种子文件)，以e<1010为阈值，筛选获得高置信度的结果。同时出现在同源比对和结构域搜索结果中的蛋白序列最终被确定为进行后续分析的MIP家族。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1蛋白和核酸序列2
1.2棉花MIP家族鉴定2
1.3棉花MIP家族系统发育分析3
1.4棉花水通道蛋白理化性质及结构分析3
1.5棉花水通道蛋白表达分析3
2结果与分析3
2.1棉花水通道蛋白鉴定3
2.2水通道蛋白系统发育分析4
2.3棉花水通道蛋白基因结构分析5
2.4棉花水通道蛋白保守序列分析6
2.5棉花水通道蛋白理化特性7
2.6棉花水通道蛋白表达分析8
2.7棉花水通道蛋白盐胁迫应答表达分析9
3讨论10
致谢11
参考文献11
棉花全基因组水通道蛋白家族基因发掘与表达分析
引言
水通道蛋白（aquaporin，AQP）是一类膜通道蛋白，在细胞膜上高效选择性转运水
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
分子和其他物质（CO2、甘油、硼酸），与离子通道、甘油通道等功能通道蛋白同属MIP（major intrinsic protein）蛋白家族，分子质量在23—31 ka[1]。水通道蛋白普遍存在于细菌、真菌、动物和植物体内[2]。在高等植物中，根据水通道蛋白的亚细胞定位，并结合水通道蛋白氨基酸序列同源性[3]，水通道蛋白又分为5个亚家族，分别是质膜膜内蛋白（PIP）[4]，液泡膜膜内蛋白（TIP）[5]，NOD26根瘤共生膜内蛋白（NIP）[6]，小碱性膜内蛋白（SIP）[7]，以及最近报道发现的X膜内蛋白（XIP）。目前已在原生动物、真菌和某些陆地植物中发现XIP的存在，例如毛果杨、烟草、番茄和马铃薯[8]。
植物水通道蛋白的结构高度保守，通道蛋白的一级结构含有6个α螺旋的跨膜区域(TM 1TM 6)，氨基酸链在膜两侧形成5个环(loop，AE) [9]，B环和E环包含高度保守的AsnProAla (NPA) 氨基酸组，是选择透过性水通道的重要组成部分。水通道蛋白序列的其他重要氨基酸残基是芳香族或精氨酸选择透过结构的组成部分。四个残基构成的这个区域（ar/R）从NPA区到细胞外侧的长度大约为8?。这四个残基是由helix2 (H2)、helix 5 (H5)、和loop E (LE1和LE2)提供[10]。该区域（ar/R）被认为是充当底物转运的一个选择性透过结构，是通过充当分子体积排阻来决定蛋白转运速率，也为输送的溶质分子和水分子提供关键的氢键和范德华力[11]。
植物生长发育过程中，水通道蛋白有效地促进了水分子快速跨膜运输，例如种子萌发、细胞伸长、气孔运动、韧皮部装载与卸载以及生殖生长。生理生化证据显示，一种公认的质膜水通道蛋白磷酸化导致水通道的激活以及调节郁金香花瓣温控开放[12]。另一研究表明，RcPIP2.1的表达与黄化下胚轴的伸长运动相关，以及该下胚轴伸长区表现出高水分传导性[13]。此外，遗传学分析同样揭示出水通道蛋白在植物生长发育过程中扮演着重要的角色。据报道，GhPIP2蛋白合成异聚体促进棉花纤维的快速伸长[14]。这些研究都论证了植物生长发育过程中水通道蛋白介导水分的跨膜转运。
大量研究已经表明，非生物胁迫（干旱、盐碱和冷害）能够诱导水通道蛋白转录积累，进一步遗传学分析证实水通道蛋白对植物抗逆起重要作用[15]。经干旱处理和盐处理，TaAQP7和TaAQP8显示出分别被诱导表达，而烟草中TaAQP7和TaAQP8的过量表达被发现是用来分别提高对干旱胁迫和盐胁迫的抵抗力[16]。MusaPIP1.2过表达的香蕉植株表现出对干旱胁迫、盐胁迫和冷害胁迫抵抗力的提高。香蕉MusaPIP1.2在拟南芥中的异源表达显示水通道蛋白通过减少膜损伤，改善膜内外离子分布和维持渗透平衡来提高对逆境的耐受力[17]。最近研究表明，MusaPIP1.2在香蕉中的常规和逆境诱导过表达都会导致植株对盐胁迫耐受力的提高[18]。总之，诸多证据表明水通道蛋白在植物非生物胁迫应答机制中具有积极意义。
全基因组分析已经在拟南芥中发掘出35条水通道蛋白[3]，水稻中有33条[19]，玉米中有36条[7]以及大白菜中有53条[20]。尽管近年来关于植物水通道蛋白研究不断，但AQP相关研究在棉花上鲜有报道。棉花是全球重要的经济作物之一，也是天然纤维的主要原料，全世界超过30个国家进行种植，在农业及国民生产中占据着重要的地位。棉花纤维产量和品质主要影响因素是水，促进水分子通过棉花细胞膜的物质是水通道蛋白。棉花全基因组测序的完成，使我们能够对棉花基因进行全基因组分析。棉花水通道蛋白家族的基因发掘和表达分析对未来研究棉花纤维的品质改良和抗逆提供了有利的条件。
1 材料与方法
1．1 植物蛋白和核酸序列来源
雷蒙德氏棉（G. raimondii），亚洲棉（G. arboreum）和陆地棉（G. hirsutum）三个棉种的全基因组序列及其注释分别从http://www.phytozome.net/, http://cgp.genomics.org.cn 和http://mascotton.njau.edu.cn/ 网站下载获得。拟南芥水通道蛋白数据来自TAIR:（http://www.arabidopsis.org）数据库。用于预测水通道蛋白结构域的种子文件PF00230，从Pfam (http://pfam.xfam.org/)下载获得。盐胁迫下戴维逊氏棉（G.davidsonii）的表达数据来自于NCBI SRA数据，数据登录号为SRP061663。
1．2 棉花MIP家族鉴定
使用三个棉种的所有被注释的蛋白 和拟南芥中已经鉴定的MIP家族进行同源比对，以e<1010为阈值，筛选获得可靠的比对结果。同时使用hmmer对三个棉种中的蛋白进行结构域的搜索(以PF00230为种子文件)，以e<1010为阈值，筛选获得高置信度的结果。同时出现在同源比对和结构域搜索结果中的蛋白序列最终被确定为进行后续分析的MIP家族。
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