二化螟碱性磷酸酯酶的异源表达及与cry1ac的互作
二化螟Chilo suppressalis（Walker）是危害我国水稻生产的一种重要鳞翅目害虫，转Bt抗虫水稻表达的外源杀虫蛋白Cry1A毒素可高效毒杀二化螟。本文为了明确二化螟体内碱性磷酸酯酶(ALP)是否为Cry1Ac毒素的功能受体，利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统和Sf9细胞系异源表达了二化螟体内的碱性磷酸酯酶。ALP1、ALP2和ALP3三种碱性磷酸酯酶均在Sf9细胞膜上表达，并可原位与Cry1Ac毒素结合，是Cry1Ac毒素的结合蛋白；在Cry1Ac毒素的作用下，分别表达了ALP1、ALP2、ALP3的Sf9细胞死亡率均有提高，但剂量效应不明显，在600nM Cry1Ac毒素的处理下死亡率仅为20%左右。ALP1、ALP2、ALP3与Cry1Ac结合后只能介导较低的细胞毒性，因此碱性磷酸酯酶不是Cry1Ac毒素在二化螟体内的功能受体。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.1.1 实验虫种与饲养 2
1.1.2 实验试剂 3
1.1.3 实验仪器与设备 3
1.2 二化螟RNA的提取 3
1.3 反转录合成第一链cDNA 3
1.4 二化螟Bt结合蛋白的基因克隆 3
1.4.1 引物设计 3
1.4.2 基因克隆 4
1.5 供体质粒的构建 4
1.5.1 PCR产物与pFastBac1载体的双酶切反应 4
1.5.2 双酶切产物的连接与转化 4
1.5.3 质粒DNA的提取 5
1.6 重组杆粒Bacmid的制备 5
1.7 重组杆状病毒的制备 5
1.7.1 转染制备P1病毒 6
1.7.2 P2病毒的制备 6
1.7.3 P3病毒的制备 6
1.8 重组蛋白的表达鉴定 6
1.9 重组蛋白的功能鉴定 7
1.9.1 重组蛋白结合性鉴定 7
1.9.2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
细胞毒力测定 7
2 结果与分析 7
2.1 碱性磷酸酯酶的异源表达 7
2.2 异源表达的ALP蛋白与Cry1Ac的互作 8
2.2.1 ALP蛋白与Cry1Ac的结合性 8
2.2.2 Cry1Ac毒素对ALP重组细胞的毒力 8
3 讨论 9
致谢 10
参考文献 10
二化螟碱性磷酸酯酶的异源表达及与Cry1Ac的互作
引言
二化螟Chilo suppressalis(Walker)属鳞翅目(Lepidoptera)，螟蛾科(Pyralidae)，是危害我国稻区最为严重的常发性害虫之一。其可以对不同生长时期的水稻造成危害，如：为害分蘖期水稻可以造成枯鞘和枯心苗；为害孕穗、抽穗期水稻可以造成枯孕穗和白穗；为害灌浆、乳熟期水稻会造成半枯穗和虫伤株等（卢代华等，2004）。目前我国螟灾的主要表现为虫口密度高，受灾范围广，受害程度重，持续时间长，经济损失大等特点（盛承发等，2003）。所以二化螟一直以来都是我国稻区的重点防治对象。到目前为止，我国主要采取化学农药的方式防治二化螟，从而使二化螟不可避免地产生了抗药性及对环境造成了污染。而苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的发现使得防治二化螟又多了一种更有效的途径。Bt毒素也从一开始被用作微生物源低毒杀虫剂来防治害虫到结合转基因技术被用作生产转基因抗虫水稻品系。
Bt毒素作用于昆虫的消化系统，造成昆虫食欲减退、行动迟缓、呕吐、腹泻等一系列症状，最终死亡。随着研究的深入，逐渐归纳出Bt毒素的3种杀虫机制，即Bravo模型(PardoLopez et al.,2013)，Zhang模型(Zhang et al., 2005)，JuratFuentes模型(JuratFuentes et al., 2006)。在此三种模式中，昆虫体内的受体蛋白在Bt毒素的毒杀过程中均发挥着至关重要的作用。到目前为止研究学者已经明确在昆虫体内至少存在6种Bt毒素受体蛋白，包括氨肽酶N (Knight,P J et al., 1994)、碱性磷酸酯酶(Alkaline Phosphatase, ALP) (Itoh et al., 1999; Fernandez et al., 2006; JuratFuentes et al., 2006)、钙粘蛋白(Vadlamudi et al., 1995)、ABC转运蛋白(Goffeau et al.,2004)、肌动蛋白(McNall et al., 2003)和糖脂类(Griffitts et al., 2005)等Bt受体蛋白。在Cry毒素发挥杀虫作用过程中，ALP作为一种重要的Bt毒素蛋白受体主要起着2方面的作用：一方面位于中肠的微绒毛上的ALP能与APN共同作用低亲和度结合活化的毒素单体，而后钙粘蛋白高亲和度结合毒素单体，催化毒素寡聚化；另一方面ALP与APN共同作用以高亲和度结合寡聚化的毒素，进而形成穿孔，导致昆虫死亡(Arenas et al.,2010)。
目前ALP在烟草天蛾(McNall et al.,2003)、烟芽夜蛾(Perera et al.,2009)以及棉铃虫(Ning et al.,2010)等多种鳞翅目昆虫已经被证实为Cry1Ac的受体，但ALP是否为Cry1A类毒素在二化螟体内的受体并不明确。本实验利用BactoBac昆虫杆状病毒表达系统对二化螟的碱性磷酸酯酶进行异源表达，并通过细胞毒力测定来分析ALP作为Cry1Ac受体在介导细胞毒性方面的功能性。本文的研究结果可明确二化螟碱性鳞酸酯酶在Bt毒素发挥毒性过程中的作用，同时为完善Bt毒素的作用机制和抗性机理奠定了理论基础。
材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验虫种及饲养
二化螟敏感品系由江苏省农科院赠送，现已于室内饲养44代。
二化螟成长过程主要分为4个时期，分别为卵期、幼虫期、蛹期和成虫期。其中幼虫期又可分为6个龄期，每个龄期均具有较为明显的形态特征，易于识别。
在饲养二化螟的过程中，不同的时期的虫子对环境条件的要求也各不相同。环境条件主要包括环境温度、湿度、光照长度等几个方面。在室内主要给其提供两个不一样的生长环境，分别为幼虫培养箱与成虫产卵培养箱。幼虫培养箱主要用于饲养幼虫，环境条件为：恒温28℃，湿度为60%，光周期为14L10D；成虫培养箱主要用于蛹羽化以及成虫产卵，所设置的环境条件为：14L10D的光周期，其中白天恒温28℃，湿度为60%，晚上恒温22℃，湿度90%以上。
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摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.1.1 实验虫种与饲养 2
1.1.2 实验试剂 3
1.1.3 实验仪器与设备 3
1.2 二化螟RNA的提取 3
1.3 反转录合成第一链cDNA 3
1.4 二化螟Bt结合蛋白的基因克隆 3
1.4.1 引物设计 3
1.4.2 基因克隆 4
1.5 供体质粒的构建 4
1.5.1 PCR产物与pFastBac1载体的双酶切反应 4
1.5.2 双酶切产物的连接与转化 4
1.5.3 质粒DNA的提取 5
1.6 重组杆粒Bacmid的制备 5
1.7 重组杆状病毒的制备 5
1.7.1 转染制备P1病毒 6
1.7.2 P2病毒的制备 6
1.7.3 P3病毒的制备 6
1.8 重组蛋白的表达鉴定 6
1.9 重组蛋白的功能鉴定 7
1.9.1 重组蛋白结合性鉴定 7
1.9.2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
细胞毒力测定 7
2 结果与分析 7
2.1 碱性磷酸酯酶的异源表达 7
2.2 异源表达的ALP蛋白与Cry1Ac的互作 8
2.2.1 ALP蛋白与Cry1Ac的结合性 8
2.2.2 Cry1Ac毒素对ALP重组细胞的毒力 8
3 讨论 9
致谢 10
参考文献 10
二化螟碱性磷酸酯酶的异源表达及与Cry1Ac的互作
引言
二化螟Chilo suppressalis(Walker)属鳞翅目(Lepidoptera)，螟蛾科(Pyralidae)，是危害我国稻区最为严重的常发性害虫之一。其可以对不同生长时期的水稻造成危害，如：为害分蘖期水稻可以造成枯鞘和枯心苗；为害孕穗、抽穗期水稻可以造成枯孕穗和白穗；为害灌浆、乳熟期水稻会造成半枯穗和虫伤株等（卢代华等，2004）。目前我国螟灾的主要表现为虫口密度高，受灾范围广，受害程度重，持续时间长，经济损失大等特点（盛承发等，2003）。所以二化螟一直以来都是我国稻区的重点防治对象。到目前为止，我国主要采取化学农药的方式防治二化螟，从而使二化螟不可避免地产生了抗药性及对环境造成了污染。而苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的发现使得防治二化螟又多了一种更有效的途径。Bt毒素也从一开始被用作微生物源低毒杀虫剂来防治害虫到结合转基因技术被用作生产转基因抗虫水稻品系。
Bt毒素作用于昆虫的消化系统，造成昆虫食欲减退、行动迟缓、呕吐、腹泻等一系列症状，最终死亡。随着研究的深入，逐渐归纳出Bt毒素的3种杀虫机制，即Bravo模型(PardoLopez et al.,2013)，Zhang模型(Zhang et al., 2005)，JuratFuentes模型(JuratFuentes et al., 2006)。在此三种模式中，昆虫体内的受体蛋白在Bt毒素的毒杀过程中均发挥着至关重要的作用。到目前为止研究学者已经明确在昆虫体内至少存在6种Bt毒素受体蛋白，包括氨肽酶N (Knight,P J et al., 1994)、碱性磷酸酯酶(Alkaline Phosphatase, ALP) (Itoh et al., 1999; Fernandez et al., 2006; JuratFuentes et al., 2006)、钙粘蛋白(Vadlamudi et al., 1995)、ABC转运蛋白(Goffeau et al.,2004)、肌动蛋白(McNall et al., 2003)和糖脂类(Griffitts et al., 2005)等Bt受体蛋白。在Cry毒素发挥杀虫作用过程中，ALP作为一种重要的Bt毒素蛋白受体主要起着2方面的作用：一方面位于中肠的微绒毛上的ALP能与APN共同作用低亲和度结合活化的毒素单体，而后钙粘蛋白高亲和度结合毒素单体，催化毒素寡聚化；另一方面ALP与APN共同作用以高亲和度结合寡聚化的毒素，进而形成穿孔，导致昆虫死亡(Arenas et al.,2010)。
目前ALP在烟草天蛾(McNall et al.,2003)、烟芽夜蛾(Perera et al.,2009)以及棉铃虫(Ning et al.,2010)等多种鳞翅目昆虫已经被证实为Cry1Ac的受体，但ALP是否为Cry1A类毒素在二化螟体内的受体并不明确。本实验利用BactoBac昆虫杆状病毒表达系统对二化螟的碱性磷酸酯酶进行异源表达，并通过细胞毒力测定来分析ALP作为Cry1Ac受体在介导细胞毒性方面的功能性。本文的研究结果可明确二化螟碱性鳞酸酯酶在Bt毒素发挥毒性过程中的作用，同时为完善Bt毒素的作用机制和抗性机理奠定了理论基础。
材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验虫种及饲养
二化螟敏感品系由江苏省农科院赠送，现已于室内饲养44代。
二化螟成长过程主要分为4个时期，分别为卵期、幼虫期、蛹期和成虫期。其中幼虫期又可分为6个龄期，每个龄期均具有较为明显的形态特征，易于识别。
在饲养二化螟的过程中，不同的时期的虫子对环境条件的要求也各不相同。环境条件主要包括环境温度、湿度、光照长度等几个方面。在室内主要给其提供两个不一样的生长环境，分别为幼虫培养箱与成虫产卵培养箱。幼虫培养箱主要用于饲养幼虫，环境条件为：恒温28℃，湿度为60%，光周期为14L10D；成虫培养箱主要用于蛹羽化以及成虫产卵，所设置的环境条件为：14L10D的光周期，其中白天恒温28℃，湿度为60%，晚上恒温22℃，湿度90%以上。
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