稻瘟病菌snare蛋白mosyn8在致病过程中的功能分析
SNAREs蛋白调节细胞膜的融合和真核细胞内的囊泡运输，并在稻瘟病(Magnaporthe oryzae）的生长发育过程中发挥着重要的作用。稻瘟病与寄主互作过程中会通过不同的SNAREs蛋白来调控效应分子蛋白转运和分泌。我们之前已经确认两种SNARE蛋白，MoSec22和MoVam7，在胞内的转运和致病过程有着重要的作用。本文主要采用基因敲除的方法对另一个SNARE蛋白MoSyn8的生物学功能进行研究。发现该基因敲除突变体ΔMosyn8营养生长变慢，分生孢子产量降低，分生孢子附着胞膨压降低，在水稻叶鞘和大麦背面表皮上的侵入率降低，扩展能力受到影响，对水稻的致病力下降。证实SNARE蛋白MoSyn8在稻瘟病菌的生长、无性繁殖和致病中有着重要的作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 供试菌株及培养条件2
1.1.2 实验用培养基2
1.2 方法2
1.2.1 稻瘟病菌DNA、RNA提取和cDNA合成2
1.2.2 MoSYN8基因载体构建和敲除突变体的获得3
1.2.2.1 MoSYN8基因敲除载体的构建3
1.2.2.2 稻瘟病菌的原生质体转化3
1.2.2.3 MoSYN8基因敲除突变体的筛选及验证4
1.2.3 MoSYN8敲除突变体的基因互补实验4
1.2.4 酵母转化4
1.2.5 MoSYN8敲除转化子生长表型观测及产孢分析5
1.2.5.1 不同培养基条件下生长速率测定5
1.2.5.2 MoSYN8敲除突变体的产孢量统计5
1.2.5.3 MoSYN8敲除突变体分生孢子形成分析5
1.2.6 MoSYN8敲除突变体的致病性分析5
1.2.6.1 水稻叶片喷雾接种5
1.2.6.2 水稻叶鞘注射接种5
1.2.7 MoSYN8突变体侵入分析5
1.2.7.1 洋葱表皮侵入分析5
1.2.7 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
.2 大麦背面表皮侵入分析5
1.2.7.3 水稻叶鞘侵入分析6
2 结果与分析6
2.1 MoSYN8敲除突变体的构建和获得6
2.2 MoSYN8突变体生长减慢7
2.3 MoSYN8突变体产孢量下降8
2.4 MoSYN8突变体致病性下降8
2.5 MoSYN8 敲除突变体侵染能力下降9
2.6 MoSYN8敲除突变体附着孢的膨压降低9
2.7 MoSYN8参与对外界胁迫的应答10
2.8 MoSYN8不参与胞外漆酶的分泌11
2.9 MoSYN8基因功能互补实验11
3 讨论11
致谢11
参考文献11
稻瘟病菌SNARE蛋白MoSyn8在致病过程中的功能分析
引言
引言: 真核细胞的细胞器主要是通过细胞内囊泡的运输来完成物质交换的，这是生物体最基本的生命现象之一，它维系着个体正常的新陈代谢及其他一系列的生命活动，对于细胞极性的建立、菌丝的生长、发育和病毒性真菌来说也是必不可少的。真菌分泌过程包括一系列在不同的膜结合的细胞器之间的囊泡运输的连续步骤。囊泡运输过程主要分为4个步骤：运输囊泡的出芽（budding）、转移（transport）、拴留（tether）和膜融合（fusion）。整个过程受到许多因子的调控，但在1980年代末期，当SNARE（soluble Nethylmaleimidesensitive factor attachment protein receptor）蛋白被发现时，就作为细胞膜融合过程的关键组分而获得普遍认同。有胞吞作用和分泌通道的细胞器包含着一套不同方式结合的SNRES蛋白 [1] 。
SNARE蛋白的命名最初源自作为N乙基马来酰胺敏感因子（Nethylmaleimide–sensitive factor，NSF）和可溶性NSF附着蛋白（soluble NSF attachment proteins，SNAP）的膜受体，即SNAPs蛋白受体（SNAP receptors，SNARE）。SNAREs蛋白是一个大家族并且在胞内运输中有一套保守的机制 [2] 。SNAREs蛋白可以由它们的位置来分类，分为tSNARE或vSNARE；另一种则是根据SNARE蛋白的氨基酸序列的相似性进行分类，将SNAREs家族成员划分为QaSNAREs、QbSNAREs、QcSNAREs和RSNAREs四类。SNARE蛋白由6070个氨基酸残基以7个一组的重复组成，通常含有C末端结构域（domain）、SNARE模体（motif）和N末端结构域。目前已在人类细胞中发现36种SNARE超家族成员，酵母中有26种，拟南芥中有54种 [3] ，但相对来说，在丝状真菌中，特别是植物病原菌如：Magnaporthe oryzae中，还是比较少的[4]。
目前SNARE蛋白介导的膜融合过程是按照一定的流程进行的，膜融合开始阶段，在SNARE模体的介导下，各SNARE蛋白聚合形成核心复合体。溶液中游离的SNARE模体为无定型结构，当适合的SNARE模体混合在一起时就能自发地聚合形成平行排列的超螺旋束。利用四螺旋束形成过程中释放出的能量促进膜融合，螺旋结构的形成导致了膜与膜之间产生了紧密的联系，并最终导致膜的融合。相反的，SNAREs蛋白的循环是由NSF介导的螺旋束的分解来实现的[5]。
Magnaporthe oryzae是一种子囊真菌亚门，并导致了稻瘟病的生成。稻瘟病菌与水稻的相互作用关系符合经典的基因对基因学说 [6]。随着水稻和稻瘟病菌的全基因组测序工作的完成，稻瘟病菌与水稻互作系统己成为研究植物病原真菌与寄主互作较为理想的模式系统之一。同时，稻瘟病菌也是研究丝状真菌生长发育和侵染致病机制的重要模式生物 [7] 。从全基因组水平分析研究稻瘟病菌关键基因的功能，可以加快对稻瘟病菌生物学及其致病分子机制的认识，为培育持久抗病品种和制定稻瘟病菌持续管理的策略提供理论依据 [8] 。
之前已有研究表明，SNARE蛋白MoSec22（secretory protein）and SNARE蛋白MoVam7n（vesicleassociated membrane protein），在稻瘟病菌的膜运输、无性发育、抗逆性和致病性等发挥着重要的作用 [9] 。MoSec22和MoVam7n的缺少会影响囊泡运输和调节胞吞的MoArk1蛋白的正常定位。为了进一步了解真菌中的SNARE蛋白在胞吞胞吐和致病性的功能，我们有针对性的进行了其他SNARE蛋白编码基因的研究工作，发现syntaxin 8(MoSyn8)参与稻瘟病菌的生长发育与致病过程。
1 材料与方法
1 材料
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 供试菌株及培养条件2
1.1.2 实验用培养基2
1.2 方法2
1.2.1 稻瘟病菌DNA、RNA提取和cDNA合成2
1.2.2 MoSYN8基因载体构建和敲除突变体的获得3
1.2.2.1 MoSYN8基因敲除载体的构建3
1.2.2.2 稻瘟病菌的原生质体转化3
1.2.2.3 MoSYN8基因敲除突变体的筛选及验证4
1.2.3 MoSYN8敲除突变体的基因互补实验4
1.2.4 酵母转化4
1.2.5 MoSYN8敲除转化子生长表型观测及产孢分析5
1.2.5.1 不同培养基条件下生长速率测定5
1.2.5.2 MoSYN8敲除突变体的产孢量统计5
1.2.5.3 MoSYN8敲除突变体分生孢子形成分析5
1.2.6 MoSYN8敲除突变体的致病性分析5
1.2.6.1 水稻叶片喷雾接种5
1.2.6.2 水稻叶鞘注射接种5
1.2.7 MoSYN8突变体侵入分析5
1.2.7.1 洋葱表皮侵入分析5
1.2.7 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
.2 大麦背面表皮侵入分析5
1.2.7.3 水稻叶鞘侵入分析6
2 结果与分析6
2.1 MoSYN8敲除突变体的构建和获得6
2.2 MoSYN8突变体生长减慢7
2.3 MoSYN8突变体产孢量下降8
2.4 MoSYN8突变体致病性下降8
2.5 MoSYN8 敲除突变体侵染能力下降9
2.6 MoSYN8敲除突变体附着孢的膨压降低9
2.7 MoSYN8参与对外界胁迫的应答10
2.8 MoSYN8不参与胞外漆酶的分泌11
2.9 MoSYN8基因功能互补实验11
3 讨论11
致谢11
参考文献11
稻瘟病菌SNARE蛋白MoSyn8在致病过程中的功能分析
引言
引言: 真核细胞的细胞器主要是通过细胞内囊泡的运输来完成物质交换的，这是生物体最基本的生命现象之一，它维系着个体正常的新陈代谢及其他一系列的生命活动，对于细胞极性的建立、菌丝的生长、发育和病毒性真菌来说也是必不可少的。真菌分泌过程包括一系列在不同的膜结合的细胞器之间的囊泡运输的连续步骤。囊泡运输过程主要分为4个步骤：运输囊泡的出芽（budding）、转移（transport）、拴留（tether）和膜融合（fusion）。整个过程受到许多因子的调控，但在1980年代末期，当SNARE（soluble Nethylmaleimidesensitive factor attachment protein receptor）蛋白被发现时，就作为细胞膜融合过程的关键组分而获得普遍认同。有胞吞作用和分泌通道的细胞器包含着一套不同方式结合的SNRES蛋白 [1] 。
SNARE蛋白的命名最初源自作为N乙基马来酰胺敏感因子（Nethylmaleimide–sensitive factor，NSF）和可溶性NSF附着蛋白（soluble NSF attachment proteins，SNAP）的膜受体，即SNAPs蛋白受体（SNAP receptors，SNARE）。SNAREs蛋白是一个大家族并且在胞内运输中有一套保守的机制 [2] 。SNAREs蛋白可以由它们的位置来分类，分为tSNARE或vSNARE；另一种则是根据SNARE蛋白的氨基酸序列的相似性进行分类，将SNAREs家族成员划分为QaSNAREs、QbSNAREs、QcSNAREs和RSNAREs四类。SNARE蛋白由6070个氨基酸残基以7个一组的重复组成，通常含有C末端结构域（domain）、SNARE模体（motif）和N末端结构域。目前已在人类细胞中发现36种SNARE超家族成员，酵母中有26种，拟南芥中有54种 [3] ，但相对来说，在丝状真菌中，特别是植物病原菌如：Magnaporthe oryzae中，还是比较少的[4]。
目前SNARE蛋白介导的膜融合过程是按照一定的流程进行的，膜融合开始阶段，在SNARE模体的介导下，各SNARE蛋白聚合形成核心复合体。溶液中游离的SNARE模体为无定型结构，当适合的SNARE模体混合在一起时就能自发地聚合形成平行排列的超螺旋束。利用四螺旋束形成过程中释放出的能量促进膜融合，螺旋结构的形成导致了膜与膜之间产生了紧密的联系，并最终导致膜的融合。相反的，SNAREs蛋白的循环是由NSF介导的螺旋束的分解来实现的[5]。
Magnaporthe oryzae是一种子囊真菌亚门，并导致了稻瘟病的生成。稻瘟病菌与水稻的相互作用关系符合经典的基因对基因学说 [6]。随着水稻和稻瘟病菌的全基因组测序工作的完成，稻瘟病菌与水稻互作系统己成为研究植物病原真菌与寄主互作较为理想的模式系统之一。同时，稻瘟病菌也是研究丝状真菌生长发育和侵染致病机制的重要模式生物 [7] 。从全基因组水平分析研究稻瘟病菌关键基因的功能，可以加快对稻瘟病菌生物学及其致病分子机制的认识，为培育持久抗病品种和制定稻瘟病菌持续管理的策略提供理论依据 [8] 。
之前已有研究表明，SNARE蛋白MoSec22（secretory protein）and SNARE蛋白MoVam7n（vesicleassociated membrane protein），在稻瘟病菌的膜运输、无性发育、抗逆性和致病性等发挥着重要的作用 [9] 。MoSec22和MoVam7n的缺少会影响囊泡运输和调节胞吞的MoArk1蛋白的正常定位。为了进一步了解真菌中的SNARE蛋白在胞吞胞吐和致病性的功能，我们有针对性的进行了其他SNARE蛋白编码基因的研究工作，发现syntaxin 8(MoSyn8)参与稻瘟病菌的生长发育与致病过程。
1 材料与方法
1 材料
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