拟南芥水通道蛋白pip2;8介导过氧化氢跨膜运输
水通道蛋白是一类镶嵌在细胞膜上的蛋白家族，最早以其运输水分进出细胞而得名。本文研究结果表明拟南芥水通道蛋白AtPIP2;8还能够运输H2O2进入细胞。表达AtPIP2;8的酵母细胞比没有表达AtPIP2;8的酵母细胞在含有3mM H2O2酵母培养基中生长缓慢，用活性氧荧光染色剂DCF对表达和不表达AtPIP2;8的酵母细胞进行染色，结果表明表达了AtPIP2;8的酵母细胞在激发光下荧光强度更大，酶标仪检测结果显示60分钟内，相同时刻表达了AtPIP2;8的酵母细胞荧光强度都明显强于未表达AtPIP2;8的酵母细胞。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1菌株和质粒 3
1.1.2引物 3
1.1.3培养基 3
1.1.4抗生素、酶等4
1.2方法5
1.2.1拟南芥RNA提取及反转录 5
1.2.2 AtPIP2;8基因的克隆 6
1.2.3 pYES2AtPIP2;8载体的构建6
1.2.4 pYES2AtPIP2;8载体转化酵母细胞及生长实验 9
2 结果与分析 10
2.1 构建pYES2AtPIP2;8 10
2.1.1成功克隆到AtPIP2;8基因 10
2.1.2成功构建pYES2AtPIP2;8载体 11
2.1.3 pYES2AtPIP2;8成功转化酵母11
2.1.4 AtPIP2;8转运H2O2的能力分析12
3讨论13
致谢14
参考文献14
拟南芥水通道蛋白PIP2;8介导过氧化氢跨膜运输
引言
引言
植物的水通道蛋白（AQPs）是一类小分子膜内在蛋白，属于生物膜上的主体内在蛋白家族(MIPs)。人们最初对水通道蛋白的认识主要集中在它们所具有的水通道活性，近来的研究发现，水通道蛋白也参与了某些生理过程中一些其他底物的跨膜转运[13]。比如干旱、盐 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
害和低温等非生物胁迫因素能够影响植物的生长，而且特别严重。从20世纪50年后期开始，有一些研究学者开始猜想：血红细胞膜上是否存在有可以传输水分子的相关蛋白[4]。到80年代中期，John Hopkins大学的Peter Agre研究小组设法从血细胞膜上提纯Rh血液组抗原的32kDa单元。他们在提纯过程中发现有一种分子量为28kDa的物质。后来从血红细胞和肾小管中分离纯化了这种蛋白[1]并命名为CHIP28。到20世纪初通过爪蟾卵母细胞表达系统证实CHIP28的水通道功能，并将CHIP28蛋白重新命名为1号水通道蛋白：aquaporin1AQP1[6]。在提纯并鉴定AQP1蛋白为水分子通道蛋白后，人们在哺乳动物中又陆续发现了多种不同的水通道蛋白。这些蛋白被归类成10种水通道蛋白，即：AQP0—AQP9。它们构成了人们通常所说的AQP水通道蛋白家族的主体。1993年Maurel等[7]研究学者从拟南芥中分离鉴定了第一个植物水通道蛋白基因γ－TIP，这是一种液泡膜内在蛋白(TIPs)，它的水分转运功能同样通过爪蟾卵母细胞表达系统得到了验证，为水通道蛋白在植物中水分转运以及渗透势调节的机理研究提供了重要的科学依据。至今已在一系列物种中发现了越来越多的水通道蛋白。例如在玉米、拟南芥、水稻、和棉花中分别发现了36、35、33、71种水通道蛋白。
科学研究证明，水通道蛋白大量存在于动物、植物等多种生物中[8]在哺乳动物中，水通道蛋白大量存在于肾脏、血细胞和眼睛等器官中，对体液渗透、泌尿等生理过程非常重要。在植物当中，水通道蛋白直接参与根部水分吸收及整个植物的水平衡。由于水通道蛋白的存在，细胞才可以快速调节自身体积和内部渗透压[9]。
根据公认的模式[1011]，植物水通道蛋白都以四聚体的形式存在，每个单体含六个跨膜螺旋结构(helix)，由五个环(loop)连接，产生直径2.8–3.4?(1?=0.1nm)的水通道，独立行使输导水分子(1.4?)的功能。四聚体在细胞膜上对称排列，形成约5?见方的间隙。由于这些结构特征，水通道蛋白不仅能输导水分子，还可以有选择地运输其他小分子化合物，如活性氧(reactive oxygen species,ROS)[12]、乙烯与CO2等气体、钙等金属离子以及甘油、蔗糖等生命活跃化合物。这些分子转运过程不仅与植物生长发育密切相关[13]，而且不同程度地影响植物微生物互作以及植物耐旱、耐盐、抗病等防卫反应[14]。
目前研究膜蛋白结构的主要方法是X光晶体学和电子晶体学。这种方法是由 Richard Henderson等人为研究二维蛋白质晶体结构而发展出来的[15]。人们通过这些方法已经成功地解出了几种重要的蛋白质结构模型。水通道蛋白是一种相对分子质量约为30ku的糖蛋白。根据拓扑结构模型[10]，植物水通道蛋白六个跨膜结构域(16)由五个环(AE)连接，五个环有两个(B、D)位于细胞膜内、三个位(A、C、E) 在外，N、C两端都定位在细胞质。跨膜结构域和B、E环构成中心水孔，B和E环各含一个保守的天冬氨酸脯氨酸丙氨酸(AsnProAla,NPA)基序，分别嵌入膜的内外两侧。两个NPA基序相向连接，形成一正一倒的漏斗结构，俩漏斗尖部对立，使通道变狭，收缩成孔缢，提高水通道的选择性。
在活性氧（ROS）中大家庭中，H2O2是一种非常重要的成员，它的分子结构和水十分相似的物质，在抗病信号传导中起着至关重要的作用。H2O2是一种活性氧(ROS)生成在不同的代谢过程,并在生物系统中作为一种氧化剂，它直接影响细胞内氧化还原系统,可以引发脂质过氧化,降低核酸和使酶失活，因此,有可能影响生理功能,导致细胞损伤甚至死亡[16]。在相对较低的浓度，H2O2出现并执行生物系统中信号转导过程的功能。它能影响基因的表达，并激活或修饰氧化还原反应敏感的转录因子，从而引发对环境压力的耐受性[1719].H2O2已被暗示作为一种细胞间的信使，通过激活和/或调制的细胞抗氧化剂和植物抗病基因[2022], 在木质部分化和木质化过程[23].信号转导过程是唯一有效的，如果快速运输的细胞间的信使分子穿过质膜可以实现。H2O2在质膜上的运动扩散信号产生以及信号感知很慢，且许多膜对过氧化氢的渗透性差。通过特定的通道蛋白可以大大提高过氧化氢跨质膜的有效传输。事实上,实验证据表明,某些水通道蛋白(AQPs) 作为peroxoporins促进过氧化氢跨生物膜的扩散[2426]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1菌株和质粒 3
1.1.2引物 3
1.1.3培养基 3
1.1.4抗生素、酶等4
1.2方法5
1.2.1拟南芥RNA提取及反转录 5
1.2.2 AtPIP2;8基因的克隆 6
1.2.3 pYES2AtPIP2;8载体的构建6
1.2.4 pYES2AtPIP2;8载体转化酵母细胞及生长实验 9
2 结果与分析 10
2.1 构建pYES2AtPIP2;8 10
2.1.1成功克隆到AtPIP2;8基因 10
2.1.2成功构建pYES2AtPIP2;8载体 11
2.1.3 pYES2AtPIP2;8成功转化酵母11
2.1.4 AtPIP2;8转运H2O2的能力分析12
3讨论13
致谢14
参考文献14
拟南芥水通道蛋白PIP2;8介导过氧化氢跨膜运输
引言
引言
植物的水通道蛋白（AQPs）是一类小分子膜内在蛋白，属于生物膜上的主体内在蛋白家族(MIPs)。人们最初对水通道蛋白的认识主要集中在它们所具有的水通道活性，近来的研究发现，水通道蛋白也参与了某些生理过程中一些其他底物的跨膜转运[13]。比如干旱、盐 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
害和低温等非生物胁迫因素能够影响植物的生长，而且特别严重。从20世纪50年后期开始，有一些研究学者开始猜想：血红细胞膜上是否存在有可以传输水分子的相关蛋白[4]。到80年代中期，John Hopkins大学的Peter Agre研究小组设法从血细胞膜上提纯Rh血液组抗原的32kDa单元。他们在提纯过程中发现有一种分子量为28kDa的物质。后来从血红细胞和肾小管中分离纯化了这种蛋白[1]并命名为CHIP28。到20世纪初通过爪蟾卵母细胞表达系统证实CHIP28的水通道功能，并将CHIP28蛋白重新命名为1号水通道蛋白：aquaporin1AQP1[6]。在提纯并鉴定AQP1蛋白为水分子通道蛋白后，人们在哺乳动物中又陆续发现了多种不同的水通道蛋白。这些蛋白被归类成10种水通道蛋白，即：AQP0—AQP9。它们构成了人们通常所说的AQP水通道蛋白家族的主体。1993年Maurel等[7]研究学者从拟南芥中分离鉴定了第一个植物水通道蛋白基因γ－TIP，这是一种液泡膜内在蛋白(TIPs)，它的水分转运功能同样通过爪蟾卵母细胞表达系统得到了验证，为水通道蛋白在植物中水分转运以及渗透势调节的机理研究提供了重要的科学依据。至今已在一系列物种中发现了越来越多的水通道蛋白。例如在玉米、拟南芥、水稻、和棉花中分别发现了36、35、33、71种水通道蛋白。
科学研究证明，水通道蛋白大量存在于动物、植物等多种生物中[8]在哺乳动物中，水通道蛋白大量存在于肾脏、血细胞和眼睛等器官中，对体液渗透、泌尿等生理过程非常重要。在植物当中，水通道蛋白直接参与根部水分吸收及整个植物的水平衡。由于水通道蛋白的存在，细胞才可以快速调节自身体积和内部渗透压[9]。
根据公认的模式[1011]，植物水通道蛋白都以四聚体的形式存在，每个单体含六个跨膜螺旋结构(helix)，由五个环(loop)连接，产生直径2.8–3.4?(1?=0.1nm)的水通道，独立行使输导水分子(1.4?)的功能。四聚体在细胞膜上对称排列，形成约5?见方的间隙。由于这些结构特征，水通道蛋白不仅能输导水分子，还可以有选择地运输其他小分子化合物，如活性氧(reactive oxygen species,ROS)[12]、乙烯与CO2等气体、钙等金属离子以及甘油、蔗糖等生命活跃化合物。这些分子转运过程不仅与植物生长发育密切相关[13]，而且不同程度地影响植物微生物互作以及植物耐旱、耐盐、抗病等防卫反应[14]。
目前研究膜蛋白结构的主要方法是X光晶体学和电子晶体学。这种方法是由 Richard Henderson等人为研究二维蛋白质晶体结构而发展出来的[15]。人们通过这些方法已经成功地解出了几种重要的蛋白质结构模型。水通道蛋白是一种相对分子质量约为30ku的糖蛋白。根据拓扑结构模型[10]，植物水通道蛋白六个跨膜结构域(16)由五个环(AE)连接，五个环有两个(B、D)位于细胞膜内、三个位(A、C、E) 在外，N、C两端都定位在细胞质。跨膜结构域和B、E环构成中心水孔，B和E环各含一个保守的天冬氨酸脯氨酸丙氨酸(AsnProAla,NPA)基序，分别嵌入膜的内外两侧。两个NPA基序相向连接，形成一正一倒的漏斗结构，俩漏斗尖部对立，使通道变狭，收缩成孔缢，提高水通道的选择性。
在活性氧（ROS）中大家庭中，H2O2是一种非常重要的成员，它的分子结构和水十分相似的物质，在抗病信号传导中起着至关重要的作用。H2O2是一种活性氧(ROS)生成在不同的代谢过程,并在生物系统中作为一种氧化剂，它直接影响细胞内氧化还原系统,可以引发脂质过氧化,降低核酸和使酶失活，因此,有可能影响生理功能,导致细胞损伤甚至死亡[16]。在相对较低的浓度，H2O2出现并执行生物系统中信号转导过程的功能。它能影响基因的表达，并激活或修饰氧化还原反应敏感的转录因子，从而引发对环境压力的耐受性[1719].H2O2已被暗示作为一种细胞间的信使，通过激活和/或调制的细胞抗氧化剂和植物抗病基因[2022], 在木质部分化和木质化过程[23].信号转导过程是唯一有效的，如果快速运输的细胞间的信使分子穿过质膜可以实现。H2O2在质膜上的运动扩散信号产生以及信号感知很慢，且许多膜对过氧化氢的渗透性差。通过特定的通道蛋白可以大大提高过氧化氢跨质膜的有效传输。事实上,实验证据表明,某些水通道蛋白(AQPs) 作为peroxoporins促进过氧化氢跨生物膜的扩散[2426]。
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