玉米寡聚核苷酸探针开发及染色体定位分析
：玉米（Zea mays（L.），2n=20）是我国重要的粮、饲、工业、药用原料兼用作物。然而由于细胞学标记有限，玉米染色体识别能力弱，因此玉米染色体研究相对落后。本文以玉米自交系Mo17和B73为试材，采用寡聚核苷酸荧光原位杂交技术（oligonucleotide fluorescence in situ hybridization，简称oligo-FISH）对新合成的寡聚核苷酸探针进行了筛选，并在此基础上建立了玉米染色体新核型，为分析我国主要玉米染色体组成及其遗传多样性提供信息。主要结果如下：在比较分析玉米全基因组序列基础上，利用双色-顺序FISH，成功开发出7个基于玉米重复序列的寡聚核苷酸探针，分别为：（ACT）10、YMPNS-CentC69-1、YMPNS-K10-72-1、YMPNS-TR1-2、YMPNS-MR68-3、Mprobe2-5和Mknob-2。利用这些探针对两个玉米自交系比较分析发现，除（ACT）10和Mprobe2-5没有明显差异外，其余探针在两个自交系上差异明显，可用于不同自交系的识别。研究还发现，（ACT）10、YMPNS-TR1-2和Mprobe2-5 FISH带型较为相似，YMPNS-MR68-3和45S rDNA探针位于相邻位置，其余3个探针信号均存在明显的差异。利用变性和非变性FISH比较发现，（ACT）10在Mo17和B73染色体上的带型一致，证明本文开发的oligos在ND-FISH中的应用潜力。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words4
引言4
1材料与方法5
1.1材料 5
1.1.1植物材料5
1.1.1探针6
1.2方法7
1.2.1根尖细胞有丝分裂中期染色体制片7
1.2.2寡聚核苷酸探针标记（随机引物法）7
1.2.3寡聚核苷酸探针标记（末端标记法）7
1.2.4变性FISH7
1.2.5非变性FISH8
1.2.6染色体分析8
2结果与分析8
2.1玉米寡聚核苷酸探针开发8
2.2简单重复序列（SSR）寡聚核苷酸探
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针及NDFISH11
2.3染色体定位11
3讨论 13
致谢15
参考文献15
玉米寡聚核苷酸探针开发及染色体定位分析
引言
引言
寡聚核苷酸（Oligos）是一类长度约几十碱基的短核苷酸的总称（包括脱氧核糖核苷酸DNA和核糖核苷酸RNA），较易与DNA分子、蛋白质或药物小分子相互作用，常用于荧光原位杂交，研究蛋白与核酸相互作用、探索DNA与药物作用的机理等（Moodie et al.1997; Hill et al.1997; Long et al.1997）。
寡聚核苷酸探针是根据探针靶序列的碱基顺序用化学方法合成的单链DNA或RNA。较质粒等探针，寡聚核苷酸探针具有很多优势。首先，任意已知DNA序列均可开发寡聚核苷酸探针，可以直接人工合成和标记修饰，省去了质粒保存、繁殖和标记的程序，更简单、经济有效。王艳芝（2013）首次把小麦质粒探针pSc119.2和pAs1转化为8个长度为5659 bp的寡聚核苷酸探针（pSc119.21 ~ 2, pAs11~ 6），发现探针pSc119.21 ~ 2可以替代质粒pSc119.2用于小麦染色体识别，特别是可用于非变性FISH，为简化染色体鉴定方法提供了新的思路，同时，她的研究还发现，根据pAs1开发的6个寡聚核苷酸探针可以产生不同的杂交信号，除了能够用于小麦D基因组染色体鉴定外，还可以用于小麦B组染色体的鉴定，从而为开发更多有效的寡聚核苷酸探针提供了重要信息。随后，Tang et al.（2014）的研究进一步证实了pSc119.2等寡核苷酸探针的有效性，并把小麦和黑麦着丝粒等序列也转化为了寡聚核苷酸探针，实现了利用寡聚核苷酸探针快速识别小麦染色体；其次，利用基因组特异序列开发的寡聚核苷酸探针可以鉴别不同物种。Xufre et al. (2006) 用酵母菌物种的26S rRNA基因的D1 / D2区域设计寡核苷酸探针对一个酵母菌菌株群体进行测试，发现这些寡聚核苷酸探针可以用于葡萄酒酵母菌物种的识别分离。而MiksKrajnik and Babuchowski（2014）则利用乳酸和丙酸细菌特异的16S rRNA序列设计寡核苷酸探针，成功实现了这两个菌种的区分；此外，相比于较长的质粒探针，短的寡聚核苷酸探针不仅可以产生质粒探针相同的杂交信号，也可以产生更多的甚至与质粒探针完全不同的杂交信号，再结合一些新的寡聚核苷酸探针，可以有效用提高染色体和染色体区段识别率，王艳芝（2013）发现pAs1分段成寡聚核苷酸后，部分探针产生了与质粒探针完全不同的信号，进一步利用pSc119.2和pAs1开发的寡核苷酸，结合Cuadrado et al.（2008）中报道的简单重复序列 (GAA)7，构建了新的普通小麦染色体的分子核型图。对比Mukai et al.（1993）利用重复序列pSc119.2和pAs1构建的普通小麦的分子核型，显著提高了中国春染色体的识别力。Farre′et al.（2012）则通过以rDNA（5S和18S5.8S26S）和微卫星[(ACT)5, (AAG)5和(CAG)5]为探针的荧光原位杂交，确定了Albacete染色体1HS.1HL3HL和3HS.3HL1HL的易位身份。
非变性荧光原位杂交技术（NDFISH）是在寡聚核苷酸探针荧光原位杂交（OligoFISH）的基础上发展起来的，一般来说是使用带有荧光标记的寡核苷酸序列作为探针，在杂交中不需要进行探针和染色体的变性便可直接进行荧光原位杂交，从而使得荧光原位杂交快速简便。Cuadrado et al.（2009）通过快速检测植物染色体端粒而无需事先进行染色体变性，建立了NDFISH技术。Cuadrado et al.（2010）在此基础上进一步发展了此技术，以SSR寡聚核苷酸为探针，进行NDFISH，发现除个别序列外，其他序列均产生了几乎与变性FISH相同的杂交效果。以SSR寡聚核苷酸(AC)8为探针运用NDFISH 技术结合SSRs分子标记，刘艳阳等（2013）成功区分了栽培芝麻中的18条染色体。更有趣的是，Fu et al. (2015)利用黑麦基因组序列，开发出了黑麦染色体专化的染色体寡聚核苷酸探针Oligo1162，这种探针信号类似于黑麦基因组探针信号，可以覆盖黑麦染色体，并通过非变性oligoFISH实现易位系等染色体变异系，替代了黑麦基因组原位杂交技术，提高了黑麦染色体变异系鉴定效率。
玉米是我国主要的粮食和饲料作物，了解玉米的染色体结构和组成，对我国玉米产业的发展和玉米种质资源的创新具有重要的意义。目前，玉米自交系B73的基因组草图序列绘制已经完成（Schnable et al. 2009），大量的玉米重复序列也已经公布在NCBI上，其中许多重复序列以质粒形式被应用于FISH分析。Kato et al.（2004）综合利用微卫星1262、亚端粒4121、5s rDNA、Cent4、CentC、Knob、NOR、端粒相关序列pMTY9ER和串联重复序列TR1克隆等质粒探针，建立了可以有效区分14个玉米自交系的多色FISH核型，为玉米染色体分析提供了有力的工具，并被Albert et al.（2010）成功用于上百份玉米核心种质和常用自交系的染色体结构分析，发现不同玉米品种染色体具有丰富的多态性，显示了该核型的重要应用潜力。Bilinski et al.（2015）综合FISH和基因组分析等方法，研究了玉米着丝粒重复序列的变化，揭示了玉米在多倍体化和物种分化过程中的演化特点。尽管如此，目前定位在玉米染色体上的特异细胞学标记依然太少，无法有效区分不同染色体臂或区段，特别是缺少基于单基因序列的可以用于准确鉴定染色体身份的特异标记，且所采用的探针均为相应重复序列的质粒克隆，获得、繁殖和保存均较费时费力，杂交程序复杂，技术难度大。
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摘要3
关键词3
Abstract3
Key words4
引言4
1材料与方法5
1.1材料 5
1.1.1植物材料5
1.1.1探针6
1.2方法7
1.2.1根尖细胞有丝分裂中期染色体制片7
1.2.2寡聚核苷酸探针标记（随机引物法）7
1.2.3寡聚核苷酸探针标记（末端标记法）7
1.2.4变性FISH7
1.2.5非变性FISH8
1.2.6染色体分析8
2结果与分析8
2.1玉米寡聚核苷酸探针开发8
2.2简单重复序列（SSR）寡聚核苷酸探
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针及NDFISH11
2.3染色体定位11
3讨论 13
致谢15
参考文献15
玉米寡聚核苷酸探针开发及染色体定位分析
引言
引言
寡聚核苷酸（Oligos）是一类长度约几十碱基的短核苷酸的总称（包括脱氧核糖核苷酸DNA和核糖核苷酸RNA），较易与DNA分子、蛋白质或药物小分子相互作用，常用于荧光原位杂交，研究蛋白与核酸相互作用、探索DNA与药物作用的机理等（Moodie et al.1997; Hill et al.1997; Long et al.1997）。
寡聚核苷酸探针是根据探针靶序列的碱基顺序用化学方法合成的单链DNA或RNA。较质粒等探针，寡聚核苷酸探针具有很多优势。首先，任意已知DNA序列均可开发寡聚核苷酸探针，可以直接人工合成和标记修饰，省去了质粒保存、繁殖和标记的程序，更简单、经济有效。王艳芝（2013）首次把小麦质粒探针pSc119.2和pAs1转化为8个长度为5659 bp的寡聚核苷酸探针（pSc119.21 ~ 2, pAs11~ 6），发现探针pSc119.21 ~ 2可以替代质粒pSc119.2用于小麦染色体识别，特别是可用于非变性FISH，为简化染色体鉴定方法提供了新的思路，同时，她的研究还发现，根据pAs1开发的6个寡聚核苷酸探针可以产生不同的杂交信号，除了能够用于小麦D基因组染色体鉴定外，还可以用于小麦B组染色体的鉴定，从而为开发更多有效的寡聚核苷酸探针提供了重要信息。随后，Tang et al.（2014）的研究进一步证实了pSc119.2等寡核苷酸探针的有效性，并把小麦和黑麦着丝粒等序列也转化为了寡聚核苷酸探针，实现了利用寡聚核苷酸探针快速识别小麦染色体；其次，利用基因组特异序列开发的寡聚核苷酸探针可以鉴别不同物种。Xufre et al. (2006) 用酵母菌物种的26S rRNA基因的D1 / D2区域设计寡核苷酸探针对一个酵母菌菌株群体进行测试，发现这些寡聚核苷酸探针可以用于葡萄酒酵母菌物种的识别分离。而MiksKrajnik and Babuchowski（2014）则利用乳酸和丙酸细菌特异的16S rRNA序列设计寡核苷酸探针，成功实现了这两个菌种的区分；此外，相比于较长的质粒探针，短的寡聚核苷酸探针不仅可以产生质粒探针相同的杂交信号，也可以产生更多的甚至与质粒探针完全不同的杂交信号，再结合一些新的寡聚核苷酸探针，可以有效用提高染色体和染色体区段识别率，王艳芝（2013）发现pAs1分段成寡聚核苷酸后，部分探针产生了与质粒探针完全不同的信号，进一步利用pSc119.2和pAs1开发的寡核苷酸，结合Cuadrado et al.（2008）中报道的简单重复序列 (GAA)7，构建了新的普通小麦染色体的分子核型图。对比Mukai et al.（1993）利用重复序列pSc119.2和pAs1构建的普通小麦的分子核型，显著提高了中国春染色体的识别力。Farre′et al.（2012）则通过以rDNA（5S和18S5.8S26S）和微卫星[(ACT)5, (AAG)5和(CAG)5]为探针的荧光原位杂交，确定了Albacete染色体1HS.1HL3HL和3HS.3HL1HL的易位身份。
非变性荧光原位杂交技术（NDFISH）是在寡聚核苷酸探针荧光原位杂交（OligoFISH）的基础上发展起来的，一般来说是使用带有荧光标记的寡核苷酸序列作为探针，在杂交中不需要进行探针和染色体的变性便可直接进行荧光原位杂交，从而使得荧光原位杂交快速简便。Cuadrado et al.（2009）通过快速检测植物染色体端粒而无需事先进行染色体变性，建立了NDFISH技术。Cuadrado et al.（2010）在此基础上进一步发展了此技术，以SSR寡聚核苷酸为探针，进行NDFISH，发现除个别序列外，其他序列均产生了几乎与变性FISH相同的杂交效果。以SSR寡聚核苷酸(AC)8为探针运用NDFISH 技术结合SSRs分子标记，刘艳阳等（2013）成功区分了栽培芝麻中的18条染色体。更有趣的是，Fu et al. (2015)利用黑麦基因组序列，开发出了黑麦染色体专化的染色体寡聚核苷酸探针Oligo1162，这种探针信号类似于黑麦基因组探针信号，可以覆盖黑麦染色体，并通过非变性oligoFISH实现易位系等染色体变异系，替代了黑麦基因组原位杂交技术，提高了黑麦染色体变异系鉴定效率。
玉米是我国主要的粮食和饲料作物，了解玉米的染色体结构和组成，对我国玉米产业的发展和玉米种质资源的创新具有重要的意义。目前，玉米自交系B73的基因组草图序列绘制已经完成（Schnable et al. 2009），大量的玉米重复序列也已经公布在NCBI上，其中许多重复序列以质粒形式被应用于FISH分析。Kato et al.（2004）综合利用微卫星1262、亚端粒4121、5s rDNA、Cent4、CentC、Knob、NOR、端粒相关序列pMTY9ER和串联重复序列TR1克隆等质粒探针，建立了可以有效区分14个玉米自交系的多色FISH核型，为玉米染色体分析提供了有力的工具，并被Albert et al.（2010）成功用于上百份玉米核心种质和常用自交系的染色体结构分析，发现不同玉米品种染色体具有丰富的多态性，显示了该核型的重要应用潜力。Bilinski et al.（2015）综合FISH和基因组分析等方法，研究了玉米着丝粒重复序列的变化，揭示了玉米在多倍体化和物种分化过程中的演化特点。尽管如此，目前定位在玉米染色体上的特异细胞学标记依然太少，无法有效区分不同染色体臂或区段，特别是缺少基于单基因序列的可以用于准确鉴定染色体身份的特异标记，且所采用的探针均为相应重复序列的质粒克隆，获得、繁殖和保存均较费时费力，杂交程序复杂，技术难度大。
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