蜡质芽胞杆菌ar156胞外多糖作为mamp因子诱导拟南芥系统抗病性的机理研究
根围非病原微生物能够被植物识别，诱导植物体产生系统抗病性。然而，植物体如何识别根围微生物并产生系统抗病性的机制尚不清晰。蜡质芽胞杆菌AR156能够诱导拟南芥对丁香假单胞菌DC3000产生系统抗性。本研究表明，蜡质芽胞杆菌AR156的胞外多糖能够作为MAMP因子，通过激活水杨酸（SA）信号通路与MAPK信号通路，诱导拟南芥体内防卫相关基因的上调表达并激活细胞免疫反应，使拟南芥植株对丁香假单胞菌DC3000产生系统抗性。由此证明胞外多糖在蜡质芽胞杆菌AR156诱导系统抗病性过程中起着重要的作用。本文首次对植物体如何识别非病原微生物，从而诱导产生系统抗病性的机理做出解释。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1供试材料3
1.1.1 供试植物材料3
1.1.2 供试菌株3
1.2供试试剂3
1.2.1拟南芥RNA提取相关试剂3
1.2.2拟南芥RNA反转录相关试剂盒3
1.2.3 荧光定量PCR相关试剂3
1.2.4 过氧化氢积累与POD、SOD活性检测相关试剂盒3
1.3 试验方法3
1.3.1 植物材料培养与菌株培养3
1.3.2 蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖的提取与纯化3
1.3.3 HR反应分析4
1.3.4 蜡质芽胞杆菌AR156组分对Pst DC3000的平板拮抗试验4
1.3.5 诱导处理4
1.3.6 Pst DC3000 在拟南芥上的定殖量测定4
1.3.7 细胞水平测定蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖诱导拟南芥抗病性4
1.3.7.1 活性氧爆发检测4
1.3.7.2 胼胝质的沉积4
1.3.7.3 防卫相关酶的活性检测4
1.3.8 拟南芥RNA提取、反转录PCR与荧光定量PCR5
1.3.9 拟南芥叶片总蛋白的提取与Western blot5
1.3.10 数据分析5
2 结果与分析 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
6
2.1蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖激发植物叶片组织HR反应6
2.2 蜡质芽胞杆菌AR156诱导拟南芥系统抗病性6
2.3 蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖诱导拟南芥中抗病相关基因的表达8
2.4蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖诱导拟南芥内活性氧积累、胼胝质沉积与防卫
相关酶的活性9
2.5 蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖诱导拟南芥系统抗病性与水杨酸信号通路及
NPR1有关11
2.6 蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖通过MAPK信号通路激活拟南芥ISR11
3讨论13
致谢15
参考文献15
蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖作为MAMP因子诱导拟南芥系统抗病性的机理研究
引言
为抵御病原物入侵，维持正常生长与新陈代谢，植物体存在一系列防卫应答机制用以应对自然界中大量的植物致病微生物——包括真菌、细菌、病毒在内[12]。这些防卫反应中最为典型的2种是系统获得性抗性（systemic acquired resistance, SAR）与诱导系统抗病性（induced systemic resistance, ISR）[2]。
其中SAR通过植物内源合成水杨酸（SA）积累激发，内源SA水平上升诱发病程相关（pathogenesisrelated, PR）蛋白PR1、PR2及PR5编码基因的表达[14]。ISR则还与茉莉酸/乙烯（JA/ET）信号通路相关，能够激活植物防卫素PDF1.2编码基因[2、56]。多种植物上都有ISR的报道，包括大豆Phaseolus vulgaris、黄瓜Cucumis sativus、烟草Nicotiana tabacum、番茄Solanum lycopersicum以及模式种拟南芥Arabidopsis thaliana等[2、5、7]。
在根围微生物（致病与非致病）与寄主互作过程中，寄主对微生物的识别是至关重要的。当非病原微生物与寄主相接触，或病原微生物侵染寄主，寄主上存在特异性受体能准确识别这些微生物。一方面，寄主细胞膜上存在某些特异受体，能够对微生物部分组分（如细胞壁、鞭毛等）进行识别，这些受体称为模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs），能够被PRR识别的微生物组分则称为微生物/病原物相关分子模式（microbe/ pathogenassociated molecular patterns, MAMPs/PAMPs）[811]。另一方面，通常在病原菌入侵时，寄主细胞受损、缺氧或应激，细胞自身也会释放多种具有免疫调节功能的细胞内分子，如寡聚半乳糖醛酸等，这些内源性危险信号即为损伤相关分子模式（damageassociated molecular patterns, DAMPs）[1116]。
由MAMPs/PAMPs引发的免疫反应称为模式诱导免疫（patterntriggered immunity, PTI）。根围细菌能通过激活SA、JA/ET信号通路等诱发多种植物产生ISR[17]，并激活细胞增强活性氧爆发、胼胝质积累[18]、防御相关酶增加[19]与次级代谢产物分泌[20]等免疫反应。flg22是一种典型的MAMP因子，是一种细菌鞭毛蛋白，在与拟南芥互作过程中被拟南芥的PRR所识别，拟南芥体内NADPH氧化酶RBOHD会介导活性氧的产生并引起胼胝质的积累[11、21]。
此前有报道称，根围微生物荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens WCS417r与蜡质芽胞杆菌Bacillus cereus AR156能诱导拟南芥对多种叶部、根部病原细菌、真菌产生ISR[1、22]。研究人员已证实，胞外多糖（extracellular polysaccharides, EPS）是微生物对外界生物与非生物胁迫做出反应所需的重要组分[2324]——通过EPS，微生物既能感知周围环境，又能与植物发生互作。由此提出假设：根围微生物胞外多糖能作为MAMP因子诱导植物对病原物产生系统抗病性。
已知蜡质芽胞杆菌Bacillus cereus AR156在拟南芥根围定殖后，能够诱导拟南芥产生对多数病原菌的抗性，研究表明，蜡质芽胞杆菌Bacillus cereus AR156能够同时激活SA与JA/ET2条信号途径[1]。本研究旨在以蜡质芽胞杆菌AR156诱导拟南芥产生对Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000（Pst DC3000）系统抗病性为模型，探究植物如何识别非病原根际微生物的定殖，非病原微生物在根际定殖后又是如何诱导植物产生系统抗病性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1供试材料3
1.1.1 供试植物材料3
1.1.2 供试菌株3
1.2供试试剂3
1.2.1拟南芥RNA提取相关试剂3
1.2.2拟南芥RNA反转录相关试剂盒3
1.2.3 荧光定量PCR相关试剂3
1.2.4 过氧化氢积累与POD、SOD活性检测相关试剂盒3
1.3 试验方法3
1.3.1 植物材料培养与菌株培养3
1.3.2 蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖的提取与纯化3
1.3.3 HR反应分析4
1.3.4 蜡质芽胞杆菌AR156组分对Pst DC3000的平板拮抗试验4
1.3.5 诱导处理4
1.3.6 Pst DC3000 在拟南芥上的定殖量测定4
1.3.7 细胞水平测定蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖诱导拟南芥抗病性4
1.3.7.1 活性氧爆发检测4
1.3.7.2 胼胝质的沉积4
1.3.7.3 防卫相关酶的活性检测4
1.3.8 拟南芥RNA提取、反转录PCR与荧光定量PCR5
1.3.9 拟南芥叶片总蛋白的提取与Western blot5
1.3.10 数据分析5
2 结果与分析 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
6
2.1蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖激发植物叶片组织HR反应6
2.2 蜡质芽胞杆菌AR156诱导拟南芥系统抗病性6
2.3 蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖诱导拟南芥中抗病相关基因的表达8
2.4蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖诱导拟南芥内活性氧积累、胼胝质沉积与防卫
相关酶的活性9
2.5 蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖诱导拟南芥系统抗病性与水杨酸信号通路及
NPR1有关11
2.6 蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖通过MAPK信号通路激活拟南芥ISR11
3讨论13
致谢15
参考文献15
蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖作为MAMP因子诱导拟南芥系统抗病性的机理研究
引言
为抵御病原物入侵，维持正常生长与新陈代谢，植物体存在一系列防卫应答机制用以应对自然界中大量的植物致病微生物——包括真菌、细菌、病毒在内[12]。这些防卫反应中最为典型的2种是系统获得性抗性（systemic acquired resistance, SAR）与诱导系统抗病性（induced systemic resistance, ISR）[2]。
其中SAR通过植物内源合成水杨酸（SA）积累激发，内源SA水平上升诱发病程相关（pathogenesisrelated, PR）蛋白PR1、PR2及PR5编码基因的表达[14]。ISR则还与茉莉酸/乙烯（JA/ET）信号通路相关，能够激活植物防卫素PDF1.2编码基因[2、56]。多种植物上都有ISR的报道，包括大豆Phaseolus vulgaris、黄瓜Cucumis sativus、烟草Nicotiana tabacum、番茄Solanum lycopersicum以及模式种拟南芥Arabidopsis thaliana等[2、5、7]。
在根围微生物（致病与非致病）与寄主互作过程中，寄主对微生物的识别是至关重要的。当非病原微生物与寄主相接触，或病原微生物侵染寄主，寄主上存在特异性受体能准确识别这些微生物。一方面，寄主细胞膜上存在某些特异受体，能够对微生物部分组分（如细胞壁、鞭毛等）进行识别，这些受体称为模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs），能够被PRR识别的微生物组分则称为微生物/病原物相关分子模式（microbe/ pathogenassociated molecular patterns, MAMPs/PAMPs）[811]。另一方面，通常在病原菌入侵时，寄主细胞受损、缺氧或应激，细胞自身也会释放多种具有免疫调节功能的细胞内分子，如寡聚半乳糖醛酸等，这些内源性危险信号即为损伤相关分子模式（damageassociated molecular patterns, DAMPs）[1116]。
由MAMPs/PAMPs引发的免疫反应称为模式诱导免疫（patterntriggered immunity, PTI）。根围细菌能通过激活SA、JA/ET信号通路等诱发多种植物产生ISR[17]，并激活细胞增强活性氧爆发、胼胝质积累[18]、防御相关酶增加[19]与次级代谢产物分泌[20]等免疫反应。flg22是一种典型的MAMP因子，是一种细菌鞭毛蛋白，在与拟南芥互作过程中被拟南芥的PRR所识别，拟南芥体内NADPH氧化酶RBOHD会介导活性氧的产生并引起胼胝质的积累[11、21]。
此前有报道称，根围微生物荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens WCS417r与蜡质芽胞杆菌Bacillus cereus AR156能诱导拟南芥对多种叶部、根部病原细菌、真菌产生ISR[1、22]。研究人员已证实，胞外多糖（extracellular polysaccharides, EPS）是微生物对外界生物与非生物胁迫做出反应所需的重要组分[2324]——通过EPS，微生物既能感知周围环境，又能与植物发生互作。由此提出假设：根围微生物胞外多糖能作为MAMP因子诱导植物对病原物产生系统抗病性。
已知蜡质芽胞杆菌Bacillus cereus AR156在拟南芥根围定殖后，能够诱导拟南芥产生对多数病原菌的抗性，研究表明，蜡质芽胞杆菌Bacillus cereus AR156能够同时激活SA与JA/ET2条信号途径[1]。本研究旨在以蜡质芽胞杆菌AR156诱导拟南芥产生对Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000（Pst DC3000）系统抗病性为模型，探究植物如何识别非病原根际微生物的定殖，非病原微生物在根际定殖后又是如何诱导植物产生系统抗病性。
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