稻曲菌tdna插入突变体b766中厚垣孢子形成相关基因的克隆
摘要：前期研究工作中获得了丧失厚垣孢子形成能力的稻曲病菌T-DNA插入突变体B-766，本研究比较了突变体B766与野生型菌株P1的生物学性状，结果表明在PSA、MM、2%TB3培养液里突变体B766比野生型菌株P1更易产生分生孢子，在PSA、MM、2%TB3平板上突变体B766的菌丝生长速度比野生型菌株P1更快。用Southern杂交检测插入突变体 B766中有3个拷贝T-DNA。用TAIL-PCR克隆T-DNA插入位点的侧翼序列并分析比对到与稻曲菌（Ustilaginoidea virens）菌株UV8b基因组数据库中JHTR01000024，JHTR01000001，JHTR01000020三条序列的相应位置，通过分析发现其中1个T-DNA拷贝插入位置距离30S核糖体蛋白S16亚基（RpsP）编码区位置最近，为507bp，T-DNA插入位置与其余基因编码区距离在1.3kb以上，推测T-DNA插入破坏了RpsP基因上游转录调控区域部分功能，进一步通过实时荧光定量PCR检测明确RpsP基因的表达量为野生型菌株P1的0.2932倍，初步推测B766中RpsP基因表达受T-DNA插入的影响而导致不能产生厚垣孢子。结果仍需进一步进行基因功能互补验证。
目录
摘要1
关键词.1
Abstract .1
Key words1引言1
1.1材料与方法2
1.1.1材料 2
1.1.1.1 培养基的配制2
1.1.1.2 供试菌株2
1.1.1.3 主要设备2
1.1.2方法 2
1.2结果与分析7 1.3讨论 11
致谢12
参考文献12
稻曲菌突变体B766中厚垣孢子相关基因的克隆
引言
引言：由Ustilaginoidea virens (Cke.)Tak.(有性态：Claviceps oryzaesativae Hashioka)引起的稻曲病已成为影响我国水稻生产的重要病害之一[1]。随着优质高产水稻的大面积推广和施肥水平的相应提高，稻曲菌在我国各主要水稻种植区大面积发生且危害日趋严重[2]
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
[3]。有效防控稻曲病已成为保障我国水稻安全生产的重要任务。稻曲病菌以厚垣孢子和菌核在病残体和土壤中越冬[46]，厚垣孢子可成为二次侵染源。其厚垣孢子可萌发直接产生分生孢子或产生菌丝；菌核可萌发产生菌丝或形成子座，子囊壳产生于子座表面，成熟后每个子囊可产生8个子囊孢子[7]。目前普遍认为，水稻的孕穗期至破口期是稻曲病菌侵染水稻花器的关键时期[5, 8, 9]。厚垣孢子在保持稻曲菌的初侵染源群体数量和病害流行中应具有重要作用。因此对稻曲病菌厚垣孢子形成关键基因的克隆和功能研究将进一步揭示厚垣孢子产生的分子机制，并为制定稻曲菌防治策略提供理论依据。本项目以丧失厚垣孢子形成能力的稻曲病菌TDNA插入突变体B766为研究材料，用TAILPCR、Southern杂交和qRTPCR等技术手段克隆厚垣孢子形成关键基因。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1供试培养基
稻曲菌TDNA插入突变体B766生物学性状所用培养基：
PSA：200g马铃薯切片煮开半小时，滤液中加入20g蔗糖，定容至1L。(固体培养基加12g琼脂粉)
MM：蔗糖，10g；琼脂，16g；溶于900mL水，121℃，30min灭菌。
母液I KH2PO4，2.0g；MgSO47H2O，0.6g。
母液II NaNO3，2.4g；NaCl ，0.1g；CaCl2，0.1g。
1L中含50mL母液I和50mL母液II。
2%TB3：酵母提取物，3g；酸水结干酪素，3g；蔗糖，20g；(固体培养基另加16g琼脂粉)，115℃，30min灭菌。
稻曲菌TDNA插入突变体 B766中TDNA拷贝数检测所用试剂：
Washing Buffer：马来酸，0.1mol/L，11.61g；NaCl，0.15mol/L，8.766g定容至1L，调PH7.5，121℃，30min灭菌。灭菌后加0.3% TNeen20 室温保存。
Maleic acid buffer：马来酸，0.1mol/L，11.61g；NaCl，0.15mol/L，8.766g；定容至1L，调PH7.5，121℃，30min灭菌。
Detection buffer：TrisHCl ，0.1mol/L， 7.88g；NaCl ，0.1mol/L，2.922g；定容至500mL，调PH9.5，121℃，30min灭菌。
Blocking solution: 现用现配，试剂盒提供,10xBlocking solution(6#) : 马来酸=1:10， 4℃存放。
Antibody solution:AntiDIGAP(4#) : Blocking solution=1:5000，AntiDIGAP(每次用前10000rpm，5min离心，取表面适量稀释 28℃，12小时)。
Denatwration Buffer：NaOH，0.5mol/L，20g；NaCl ，1.5mol/L，87.66g定容至1L，121℃，30min灭菌。
Neutralization solution：TrisHcl ，0.5mol/L ，60.57g ；NaCl ，1.5mol/L， 87.66g；PH7.5，定容至1L，121℃，30min灭菌。
20xSSC：NaCl，3mol/L，175.32g；柠檬酸钠 ，0.3mol/L ，88.23g； 定容至1L，ph7.0，121℃，30min灭菌。
EDTA ：0.2mol/L→7.444g定容至100mL，PH8.0，121℃，30min，灭菌。
10%SDS：10g SDS定容至100mL，过滤除渣。
6种限制性内切酶: Xba I，Xho I，EcoR V，Sal I，Hind III，BamH I
地高辛Southern杂交试剂盒（Roche，国家）
1.1. 2 供试菌株
P1：野生型强致病力菌株，B766：P1的TDNA插入突变体。
1.1. 3 主要设备
杂交炉，紫外交联仪。
超净工作台，实时荧光定量仪。
1.2 试验方法
1. 2.1稻曲菌TDNA插入突变体B766生物学性状观察和测定
菌丝生长能力测定：用5mm直径的打孔器打取B766与P1菌落边缘新鲜菌丝块接种至PSA、MM、2%TB3的平板中，每个处理4个重复。28℃培养14天，用十字交叉法量取每个培养基上菌落直径。
分生孢子产孢能力测定：用5mm直径的打孔器打取B766与P1菌落边缘新鲜菌丝块接种至30 mL的PSA、MM和TB3的培养液中，每个处理4个重复。28℃，150r/min摇床中摇培7天后取出用血球计数板测定分生孢子浓度。
菌落生长形态观察：观察以上固体培养基和液体培养基中菌落或菌丝球的生长形态。
目录
摘要1
关键词.1
Abstract .1
Key words1引言1
1.1材料与方法2
1.1.1材料 2
1.1.1.1 培养基的配制2
1.1.1.2 供试菌株2
1.1.1.3 主要设备2
1.1.2方法 2
1.2结果与分析7 1.3讨论 11
致谢12
参考文献12
稻曲菌突变体B766中厚垣孢子相关基因的克隆
引言
引言：由Ustilaginoidea virens (Cke.)Tak.(有性态：Claviceps oryzaesativae Hashioka)引起的稻曲病已成为影响我国水稻生产的重要病害之一[1]。随着优质高产水稻的大面积推广和施肥水平的相应提高，稻曲菌在我国各主要水稻种植区大面积发生且危害日趋严重[2]
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
[3]。有效防控稻曲病已成为保障我国水稻安全生产的重要任务。稻曲病菌以厚垣孢子和菌核在病残体和土壤中越冬[46]，厚垣孢子可成为二次侵染源。其厚垣孢子可萌发直接产生分生孢子或产生菌丝；菌核可萌发产生菌丝或形成子座，子囊壳产生于子座表面，成熟后每个子囊可产生8个子囊孢子[7]。目前普遍认为，水稻的孕穗期至破口期是稻曲病菌侵染水稻花器的关键时期[5, 8, 9]。厚垣孢子在保持稻曲菌的初侵染源群体数量和病害流行中应具有重要作用。因此对稻曲病菌厚垣孢子形成关键基因的克隆和功能研究将进一步揭示厚垣孢子产生的分子机制，并为制定稻曲菌防治策略提供理论依据。本项目以丧失厚垣孢子形成能力的稻曲病菌TDNA插入突变体B766为研究材料，用TAILPCR、Southern杂交和qRTPCR等技术手段克隆厚垣孢子形成关键基因。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1供试培养基
稻曲菌TDNA插入突变体B766生物学性状所用培养基：
PSA：200g马铃薯切片煮开半小时，滤液中加入20g蔗糖，定容至1L。(固体培养基加12g琼脂粉)
MM：蔗糖，10g；琼脂，16g；溶于900mL水，121℃，30min灭菌。
母液I KH2PO4，2.0g；MgSO47H2O，0.6g。
母液II NaNO3，2.4g；NaCl ，0.1g；CaCl2，0.1g。
1L中含50mL母液I和50mL母液II。
2%TB3：酵母提取物，3g；酸水结干酪素，3g；蔗糖，20g；(固体培养基另加16g琼脂粉)，115℃，30min灭菌。
稻曲菌TDNA插入突变体 B766中TDNA拷贝数检测所用试剂：
Washing Buffer：马来酸，0.1mol/L，11.61g；NaCl，0.15mol/L，8.766g定容至1L，调PH7.5，121℃，30min灭菌。灭菌后加0.3% TNeen20 室温保存。
Maleic acid buffer：马来酸，0.1mol/L，11.61g；NaCl，0.15mol/L，8.766g；定容至1L，调PH7.5，121℃，30min灭菌。
Detection buffer：TrisHCl ，0.1mol/L， 7.88g；NaCl ，0.1mol/L，2.922g；定容至500mL，调PH9.5，121℃，30min灭菌。
Blocking solution: 现用现配，试剂盒提供,10xBlocking solution(6#) : 马来酸=1:10， 4℃存放。
Antibody solution:AntiDIGAP(4#) : Blocking solution=1:5000，AntiDIGAP(每次用前10000rpm，5min离心，取表面适量稀释 28℃，12小时)。
Denatwration Buffer：NaOH，0.5mol/L，20g；NaCl ，1.5mol/L，87.66g定容至1L，121℃，30min灭菌。
Neutralization solution：TrisHcl ，0.5mol/L ，60.57g ；NaCl ，1.5mol/L， 87.66g；PH7.5，定容至1L，121℃，30min灭菌。
20xSSC：NaCl，3mol/L，175.32g；柠檬酸钠 ，0.3mol/L ，88.23g； 定容至1L，ph7.0，121℃，30min灭菌。
EDTA ：0.2mol/L→7.444g定容至100mL，PH8.0，121℃，30min，灭菌。
10%SDS：10g SDS定容至100mL，过滤除渣。
6种限制性内切酶: Xba I，Xho I，EcoR V，Sal I，Hind III，BamH I
地高辛Southern杂交试剂盒（Roche，国家）
1.1. 2 供试菌株
P1：野生型强致病力菌株，B766：P1的TDNA插入突变体。
1.1. 3 主要设备
杂交炉，紫外交联仪。
超净工作台，实时荧光定量仪。
1.2 试验方法
1. 2.1稻曲菌TDNA插入突变体B766生物学性状观察和测定
菌丝生长能力测定：用5mm直径的打孔器打取B766与P1菌落边缘新鲜菌丝块接种至PSA、MM、2%TB3的平板中，每个处理4个重复。28℃培养14天，用十字交叉法量取每个培养基上菌落直径。
分生孢子产孢能力测定：用5mm直径的打孔器打取B766与P1菌落边缘新鲜菌丝块接种至30 mL的PSA、MM和TB3的培养液中，每个处理4个重复。28℃，150r/min摇床中摇培7天后取出用血球计数板测定分生孢子浓度。
菌落生长形态观察：观察以上固体培养基和液体培养基中菌落或菌丝球的生长形态。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/zwbh/754.html
