柑橘全爪螨的est数据库的微卫星开发实验
摘要：柑橘全爪螨是柑橘作物上的一种重要经济害虫，为了更好地了解柑橘全爪螨的种群遗传结构，我们基于表达序列标签（EST）数据库开发了15个柑橘全爪螨的多态性微卫星标记，并通过采自福建省泉州市的32雌成螨评价了这些微卫星的多样性。结果显示每个位点的多态性信息含量(PIC)在0.305到0.726不等，平均数据为0.491。每个位点的等位基因数目在2到6之间，平均数目为3.8。表观的和预期的杂合性分别在0.094到0.438以及0.345到0.764的范围内变化。连锁不平衡检测结果表明三对微卫星位点（PC3和PC9，PC3和PC11，PC11和PC9)存在显著连锁现象。新开发的15个微卫星位点中有12个明显偏离哈迪温伯格平衡（HWE）。我们推测这可能是由于无效基因的存在，近亲繁殖及华伦德（Wahlund）效应造成的。总体来说，这些新开发的微卫星标记具有较好的遗传多态性，为将来柑橘全爪螨的种群遗传学的研究提供了有价值的来源。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2实验方法 2
1.2.1叶螨鉴定及DNA提取2
1.2.2序列搜索及引物设计2
1.2.3PCR扩增及多态性因物筛选3
1.2.4数据处理3
2结果与分析3
2.1引物设计及PCR扩增效果检验3
2.2多态性引物筛选 5
2.3杂合子缺乏原因分析 5
2.3.1无效等位基因的存在 5
2.3.2近亲繁殖 6
2.3.3华伦德效应 6
3讨论 6
致谢6
参考文献7
基于柑橘全爪螨的EST数据库的微卫星开发实验
引言
柑橘全爪螨[Panonychus citri (McGregor) ]属真螨总目绒螨目，叶螨总科，叶螨科。它是一种世界性的柑橘害螨，主要分布于中国、美国、日本、印度、南非和地中海国家。它是柑橘产区普遍发生、危害最严重的害螨[1]。柑橘全爪螨寄主广泛，除柑橘类外，还危害梨、
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
桃、柿、枣、桂花、垂柳、月季和一品红等经济作物和园艺观赏植。柑橘全爪螨以成螨、若螨和幼螨群集于嫩叶枝梢及果实上刺吸汁液，但以叶片受害最重，被害叶片呈现许多灰白色小斑点，失去光泽，严重时全叶灰白，造成大量落叶、落果，影响树势和柑橘果产量[2]。
近年来，我国对柑橘全爪螨的防控主要是依靠化学杀螨剂，然而，由于化学农药的滥用，柑橘全爪螨种群产生的杀螨剂抗性逐渐成为一个重要的问题[3]。除了化学防治，生物防治也被应用于防治螨的危害。从生物防治的角度来看，为了更好地控制柑橘全爪螨，了解其种群遗传结构是非常有必要地，因为它可以阐明柑橘全爪螨的种群动态[4]。为了实现这一目标,需要大量的多态性分子标记，在之前的柑橘全爪螨群体遗传学研究实验中所使用的是同工酶[5]、COI[6]和ITS1[7]序列，但由于多态性比较低，或者在基因组中存在多拷贝现象，这些分子标记并不是种群遗传结构研究的理想标记。
近年来，由于微卫星（simple sequence repeats，SSR）标记在基因组中数量多、多态性高、中性及复等位的优点使其在种群遗传结构分析中被广泛的应用。其被广泛应用于种群遗传学中，用来推算群体间分化程度、有效种群大小、基因流及种群进化历史等。但微卫星标记的引物通常需要构建微卫星富集文库文库来开发，此种方法费时费力、低效率并且价格昂贵[8]。而对于柑橘全爪螨这种小型动物，由于其体型微小,使得我们很难从柑橘全爪螨中获得高纯度的DNA，以用于微卫星文库的构建。因此，到目前为止，只有一个可用于柑橘全爪螨的微卫星标记[9]。但是，如今大量的EST序列登录在了NCBI数据库，这些序列可以用来开发柑橘全爪螨的微卫星。相对于微卫星文库建立方法，筛选大量的EST更有利于开发高质量的标记。本研究，我们基于EST数据开发了柑橘全爪螨的微卫星。这些微卫星为柑橘全爪螨的种群遗传结构研究提供了新的手段。
1 材料与方法
1．1 实验材料
在福建泉州10x10米的柑橘树范围内采集柑橘全爪螨，并立即放入70%的酒精中保存带回实验室。提取DNA的MIX配置如下：每只材料所需Nuclei Lysis Solution 200μL，0.5M EDTA(pH8.0) 50μL，Proteinase K，20mg/ml 20μL，RNase A Solution 5μL。
1．2 实验方法
1．2．1 叶螨鉴定和DNA提取
鉴定是基于柑橘全爪螨的形态特征和细胞色素氧化酶基因I（COI）的部分序列[10]，DNA提取是通过Wizard?SV基因组DNA纯化试剂盒进行。
1）将浸泡在酒精里的叶螨取出，放在一次性培养皿中用无水酒精漂洗三次后，放在干净卫生纸，再放入超净工作台；
2）晾干后用promega试剂盒提取DNA；
3）取单头叶螨与1.5mL离心管中，加入50μL MIX研磨；
4）加入225μL MIX冲洗研磨棒；
5）蜗旋混匀，并简单离心，55度水浴，1618h
6）加入250μL Wizard SV Lysis Buffer，并蜗旋混匀（此步骤之后操作需要加快，lysate must remain warm）；
7）将混合液转入Minicolumassembly，13000g离心，3min；
8）倒掉收集管中的液体，将过滤管重新放回，加入65μL Wash Solution；
9）13000g离心，1min；
10）重复89三次；
11）洗完后重新放入离心管中，13000g离心2min；
12）室温放置10min；
13）放入新管中，加入60μL65度的水，室温放置2min，13000g，离心1min；
1．2．2 序列搜索及引物设计
1）在NCBI中输入ERX021800(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)，下载柑橘全爪螨的EST序列；
2）采用Trinity软件，选择默认参数[11]对这些EST序列进行聚类和拼接并截去小于350bp的过短序列；
3）进行序列处理及拼接后，我们获得由15213条，总长度为15.3Mb的非冗余序列基因(unigeges)。之后，用SciRoKo3.4软件[12]分析获得的非冗余序列基因以查找含有简单重复序列的部分，查找的标准是二核苷酸的重复次数大于4的序列，总共有1950条微卫星序列被确定；
4）以Primer premier3设计引物[13]，设计的标准是GC含量在40%60%，产物长度在100300bp，Tm在5258℃，且上下游引物Tm值不超过3℃；
5）在这些序列中913个的引物设计成功，我们随机选择120对引物，进行PCR验证。然后用BLASTX程序将选中的ESTs序列与NCBI中蛋白质数据库进行同源比对与注释，认定阈值为1e7；
1．2．3 PCR扩增及多态性引物筛选
1）首先通过4个柑橘全爪螨雌成螨的DNA作为扩增模板进行PCR，以检测所设微卫星引物的扩增效率。PCR扩增体系（总体积10μL)如下：上下游引物各0.2μmol/L，模板DNA10100ng/μL,dNTP0.2 mmol/L，TaqDNA聚合酶0.1U/μL。反应程序为：95℃预变性3min；94℃ 30s，55℃（据设计引物情况调整）30s，72℃ 30s，进行35个循环，72℃ 15min；
目录
摘要1
关键词1
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Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2实验方法 2
1.2.1叶螨鉴定及DNA提取2
1.2.2序列搜索及引物设计2
1.2.3PCR扩增及多态性因物筛选3
1.2.4数据处理3
2结果与分析3
2.1引物设计及PCR扩增效果检验3
2.2多态性引物筛选 5
2.3杂合子缺乏原因分析 5
2.3.1无效等位基因的存在 5
2.3.2近亲繁殖 6
2.3.3华伦德效应 6
3讨论 6
致谢6
参考文献7
基于柑橘全爪螨的EST数据库的微卫星开发实验
引言
柑橘全爪螨[Panonychus citri (McGregor) ]属真螨总目绒螨目，叶螨总科，叶螨科。它是一种世界性的柑橘害螨，主要分布于中国、美国、日本、印度、南非和地中海国家。它是柑橘产区普遍发生、危害最严重的害螨[1]。柑橘全爪螨寄主广泛，除柑橘类外，还危害梨、
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
桃、柿、枣、桂花、垂柳、月季和一品红等经济作物和园艺观赏植。柑橘全爪螨以成螨、若螨和幼螨群集于嫩叶枝梢及果实上刺吸汁液，但以叶片受害最重，被害叶片呈现许多灰白色小斑点，失去光泽，严重时全叶灰白，造成大量落叶、落果，影响树势和柑橘果产量[2]。
近年来，我国对柑橘全爪螨的防控主要是依靠化学杀螨剂，然而，由于化学农药的滥用，柑橘全爪螨种群产生的杀螨剂抗性逐渐成为一个重要的问题[3]。除了化学防治，生物防治也被应用于防治螨的危害。从生物防治的角度来看，为了更好地控制柑橘全爪螨，了解其种群遗传结构是非常有必要地，因为它可以阐明柑橘全爪螨的种群动态[4]。为了实现这一目标,需要大量的多态性分子标记，在之前的柑橘全爪螨群体遗传学研究实验中所使用的是同工酶[5]、COI[6]和ITS1[7]序列，但由于多态性比较低，或者在基因组中存在多拷贝现象，这些分子标记并不是种群遗传结构研究的理想标记。
近年来，由于微卫星（simple sequence repeats，SSR）标记在基因组中数量多、多态性高、中性及复等位的优点使其在种群遗传结构分析中被广泛的应用。其被广泛应用于种群遗传学中，用来推算群体间分化程度、有效种群大小、基因流及种群进化历史等。但微卫星标记的引物通常需要构建微卫星富集文库文库来开发，此种方法费时费力、低效率并且价格昂贵[8]。而对于柑橘全爪螨这种小型动物，由于其体型微小,使得我们很难从柑橘全爪螨中获得高纯度的DNA，以用于微卫星文库的构建。因此，到目前为止，只有一个可用于柑橘全爪螨的微卫星标记[9]。但是，如今大量的EST序列登录在了NCBI数据库，这些序列可以用来开发柑橘全爪螨的微卫星。相对于微卫星文库建立方法，筛选大量的EST更有利于开发高质量的标记。本研究，我们基于EST数据开发了柑橘全爪螨的微卫星。这些微卫星为柑橘全爪螨的种群遗传结构研究提供了新的手段。
1 材料与方法
1．1 实验材料
在福建泉州10x10米的柑橘树范围内采集柑橘全爪螨，并立即放入70%的酒精中保存带回实验室。提取DNA的MIX配置如下：每只材料所需Nuclei Lysis Solution 200μL，0.5M EDTA(pH8.0) 50μL，Proteinase K，20mg/ml 20μL，RNase A Solution 5μL。
1．2 实验方法
1．2．1 叶螨鉴定和DNA提取
鉴定是基于柑橘全爪螨的形态特征和细胞色素氧化酶基因I（COI）的部分序列[10]，DNA提取是通过Wizard?SV基因组DNA纯化试剂盒进行。
1）将浸泡在酒精里的叶螨取出，放在一次性培养皿中用无水酒精漂洗三次后，放在干净卫生纸，再放入超净工作台；
2）晾干后用promega试剂盒提取DNA；
3）取单头叶螨与1.5mL离心管中，加入50μL MIX研磨；
4）加入225μL MIX冲洗研磨棒；
5）蜗旋混匀，并简单离心，55度水浴，1618h
6）加入250μL Wizard SV Lysis Buffer，并蜗旋混匀（此步骤之后操作需要加快，lysate must remain warm）；
7）将混合液转入Minicolumassembly，13000g离心，3min；
8）倒掉收集管中的液体，将过滤管重新放回，加入65μL Wash Solution；
9）13000g离心，1min；
10）重复89三次；
11）洗完后重新放入离心管中，13000g离心2min；
12）室温放置10min；
13）放入新管中，加入60μL65度的水，室温放置2min，13000g，离心1min；
1．2．2 序列搜索及引物设计
1）在NCBI中输入ERX021800(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)，下载柑橘全爪螨的EST序列；
2）采用Trinity软件，选择默认参数[11]对这些EST序列进行聚类和拼接并截去小于350bp的过短序列；
3）进行序列处理及拼接后，我们获得由15213条，总长度为15.3Mb的非冗余序列基因(unigeges)。之后，用SciRoKo3.4软件[12]分析获得的非冗余序列基因以查找含有简单重复序列的部分，查找的标准是二核苷酸的重复次数大于4的序列，总共有1950条微卫星序列被确定；
4）以Primer premier3设计引物[13]，设计的标准是GC含量在40%60%，产物长度在100300bp，Tm在5258℃，且上下游引物Tm值不超过3℃；
5）在这些序列中913个的引物设计成功，我们随机选择120对引物，进行PCR验证。然后用BLASTX程序将选中的ESTs序列与NCBI中蛋白质数据库进行同源比对与注释，认定阈值为1e7；
1．2．3 PCR扩增及多态性引物筛选
1）首先通过4个柑橘全爪螨雌成螨的DNA作为扩增模板进行PCR，以检测所设微卫星引物的扩增效率。PCR扩增体系（总体积10μL)如下：上下游引物各0.2μmol/L，模板DNA10100ng/μL,dNTP0.2 mmol/L，TaqDNA聚合酶0.1U/μL。反应程序为：95℃预变性3min；94℃ 30s，55℃（据设计引物情况调整）30s，72℃ 30s，进行35个循环，72℃ 15min；
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