水稻粉质胚乳突变体b136的基因初定位
稻米胚乳的主要成分是淀粉，以淀粉颗粒的形式存在于造粉体中，其含量和性质直接影响稻米的品质。本研究通过筛选水稻W017 MNU诱变的突变体库，发现一个稳定遗传的胚乳突变体 B136，对其表型进行观察分析，并对目标基因进行初步定位。结果表明，B136呈现胚乳粉质；与野生型相比，B136直链淀粉含量显著增加，支链淀粉链长分布也发生了明显变化。B136突变基因初定位在第11号染色体标记I11-9和N11-29之间，物理距离约3.7Mb。本研究为进一步精细定位及图位克隆获得目的基因奠定了基础，对研究水稻淀粉合成相关基因具有一定的意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 材料获取3
1.2 方法 3
1.2.1 成熟种子断面的扫描电镜观察 3
1.2.2 直链淀粉含量的测定 3
1.2.3 米粉支链淀粉链长分布检测 3
1.3 目的基因的初定位 3
1.3.1 隐性极端个体的挑选3
1.3.2 叶片总DNA的提取4
1.3.3 PCR扩增4
1.3.4 PCR产物检测5
1.3.5 多态标记筛选5
2 结果与分析6
2.1 表型分析6
2.1.1 突变体种子表现为粉质、不透明6
2.1.2 突变体种子直链淀粉含量增加 6
2.1.3 突变体的支链淀粉链长分布变化 7
2.2 B136 的初步定位8
2.2.1 遗传分析8
2.2.2 B136的初定位 8
3讨论9
3.1 B136粉质突变体中很可能含有一个未报道的新基因 9
3.2 水稻胚乳粉质突变体的研究意义9
致谢9
参考文献9
水稻粉质胚乳突变体B136的基因初定位
引言
引言
水稻有着近5000年的种植历史，是世界上最重要的粮食作物之一，世界上有三分之一以上的人口以稻米为
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主食[1]。近年来，随着中国国民经济的发展，消费者对优质稻米的需求量不断增长；另一方面，国际市场对国内市场带来的影响和冲击加剧，优质稻米的研究开发已经迫在眉睫。而淀粉是稻米籽粒最重要的组成成分。稻米的淀粉含量和结构分布的差异对水稻品质影响巨大。
稻米籽粒中淀粉的生物合成和积累的过程实质上是稻米品质性状的形成过程。这一过程发生在稻米造粉体中，并在一系列酶的催化作用下形成。因此育种者对加强优质稻米淀粉合成途径及相关酶基因的研究应该高度重视，这对于选育优质水稻品种至关重要。
淀粉按照不同的分类标准，可将其分为不同的类型，其中最常见的是从化学成分上将淀粉分为直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉占总稻米淀粉的2030%，由αD葡萄糖通过α1,4糖苷键连接而成的具有一定螺旋的线形结构，溶于热水，遇碘形成蓝色复合物；支链淀粉则是以葡萄糖为单位的高度分支的多聚物，遇碘显紫红色或紫色，由αl,4糖苷键和位于分支点上的α1,6糖苷键共同连接形成的。目前普遍接受的结构为“簇状模式”，支链淀粉分支有三种类型，分别称为A 链、B 链和 C 链。A 链是最外层的侧链，其还原末端通过α1,6糖苷键与内层的B链相连，A链本身不再分支；而B链和C链以α1,6糖苷键相连；C链是唯一的一条含有还原末端的分支，是支链淀粉分子的主链，每个支链淀粉分子只有一条C链[2]。
淀粉生物合成的相关研究已经表明，ADPG葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase，ADP glucose pyrophosphorylase）、淀粉合成酶（SS，starch synthase）、淀粉分支酶（SBE，starch branching enzyme）和淀粉去分支酶（DBE，debranching enzyme）是淀粉合成过程中的4类关键酶。其中，AGPase负责提供碳链的前体物质ADPG，GBSS参与直链淀粉合成，SSS、SBE、DBE则参与支链淀粉的形成[3]。
目前已经在水稻中发现了一系列淀粉突变体，包括粉质 (floury, flo)、糖质(sugary, su)、糯性(waxy, wx)、暗色(dull, du)、心白(whitecore, wc)、皱缩(shrunken, sh)等类型。这些突变体是研究水稻籽粒淀粉生物合成的理想材料。其中，Wx基因在1988年已被克隆出来，位于第6染色体，由13个内含子和14个外显子组成[4]，编码GBSSI蛋白。抑制Wx基因的表达,会降低GBSSI酶的活性,进而导致直链淀粉含量显著下降，表现为糯性。Satoh et al.于1981年通过N甲基N亚硝基脲(MNU)处理受精卵得到了一系列淀粉粉质突变体，命名为flo1flo5[56]。而后flo6和flo7也相继被发现和报导。其中flo4、flo5、flo2、flo7都已被克隆，flo1、flo3都已被精细定位。FLO4位于第5染色体，在flo4突变体中，胚乳内部呈现粉质的状态，但外圈是正常的，淀粉粒排列松散，直链淀粉含量下降3%左右，然而总淀粉含量基本没有变化。在flo5突变体中，种子中间部分表现为粉质性状，外层无变化，中间粉质部分的扫描电镜观察显示，淀粉颗粒更小更圆，同时淀粉粒松散排布。FLO5位于第8染色体，编码OsSSIIIa，在开花后515天表达量最大[7]。FLO2位于第4染色体，含有23个外显子和22个内含子，编码一个含有功能未知的保守序列。flo2 突变体的整个种子在长度和宽度上都比较小，且都表现为粉质，电镜观察显示胚乳中淀粉粒比野生型小，排列松散[7]。FLO1位于第5染色体，FLO3位于第4染色体，胚乳均呈现粉质，淀粉粒排列松散。本实验室利用MNU诱变获得一系列粉质突变体，并已成功克隆一个新基因，命名为FLO6。FLO6位于第3染色体长臂，编码一个植物特异的CBM48蛋白，参与水稻胚乳中复合淀粉颗粒的形成[8]。在整个种子发育过程中，flo6突变体的灌浆速率明显低于野生型。在灌浆结束后，和野生型透明的种子相比，flo6突变体呈现小而且粉质不透明的种子。利用扫描电镜观察突变体籽粒断面，还发现突变体中淀粉颗粒排列松散。目前，对于暗色基因dull1和dull3的研究较为详细。研究表明，dull1和dull3突变体的直链淀粉含量比糯米高，但是都明显低于野生型，且dull3高于dull1；这两个突变体中Wxb基因的premRNA的剪切效率都会降低，且都通过图位克隆的方法将dull1基因定位于第10染色体，将dull3定位于第2染色体的长臂上[910]。另外，ae（amyloseextender）突变体中直链淀粉含量显著增加，SSSI活性显著下降。Ae基因具有剂量效应，因为胚乳为三倍体，基因型为aeaeae的种子明显变小，种子干重只有野生型的65%，AeAeae和Aeaeae基因型的种子则略小于野生型，干重分别为野生型的99%和97%[11]。
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摘要1
关键词1
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Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 材料获取3
1.2 方法 3
1.2.1 成熟种子断面的扫描电镜观察 3
1.2.2 直链淀粉含量的测定 3
1.2.3 米粉支链淀粉链长分布检测 3
1.3 目的基因的初定位 3
1.3.1 隐性极端个体的挑选3
1.3.2 叶片总DNA的提取4
1.3.3 PCR扩增4
1.3.4 PCR产物检测5
1.3.5 多态标记筛选5
2 结果与分析6
2.1 表型分析6
2.1.1 突变体种子表现为粉质、不透明6
2.1.2 突变体种子直链淀粉含量增加 6
2.1.3 突变体的支链淀粉链长分布变化 7
2.2 B136 的初步定位8
2.2.1 遗传分析8
2.2.2 B136的初定位 8
3讨论9
3.1 B136粉质突变体中很可能含有一个未报道的新基因 9
3.2 水稻胚乳粉质突变体的研究意义9
致谢9
参考文献9
水稻粉质胚乳突变体B136的基因初定位
引言
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水稻有着近5000年的种植历史，是世界上最重要的粮食作物之一，世界上有三分之一以上的人口以稻米为
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主食[1]。近年来，随着中国国民经济的发展，消费者对优质稻米的需求量不断增长；另一方面，国际市场对国内市场带来的影响和冲击加剧，优质稻米的研究开发已经迫在眉睫。而淀粉是稻米籽粒最重要的组成成分。稻米的淀粉含量和结构分布的差异对水稻品质影响巨大。
稻米籽粒中淀粉的生物合成和积累的过程实质上是稻米品质性状的形成过程。这一过程发生在稻米造粉体中，并在一系列酶的催化作用下形成。因此育种者对加强优质稻米淀粉合成途径及相关酶基因的研究应该高度重视，这对于选育优质水稻品种至关重要。
淀粉按照不同的分类标准，可将其分为不同的类型，其中最常见的是从化学成分上将淀粉分为直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉占总稻米淀粉的2030%，由αD葡萄糖通过α1,4糖苷键连接而成的具有一定螺旋的线形结构，溶于热水，遇碘形成蓝色复合物；支链淀粉则是以葡萄糖为单位的高度分支的多聚物，遇碘显紫红色或紫色，由αl,4糖苷键和位于分支点上的α1,6糖苷键共同连接形成的。目前普遍接受的结构为“簇状模式”，支链淀粉分支有三种类型，分别称为A 链、B 链和 C 链。A 链是最外层的侧链，其还原末端通过α1,6糖苷键与内层的B链相连，A链本身不再分支；而B链和C链以α1,6糖苷键相连；C链是唯一的一条含有还原末端的分支，是支链淀粉分子的主链，每个支链淀粉分子只有一条C链[2]。
淀粉生物合成的相关研究已经表明，ADPG葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase，ADP glucose pyrophosphorylase）、淀粉合成酶（SS，starch synthase）、淀粉分支酶（SBE，starch branching enzyme）和淀粉去分支酶（DBE，debranching enzyme）是淀粉合成过程中的4类关键酶。其中，AGPase负责提供碳链的前体物质ADPG，GBSS参与直链淀粉合成，SSS、SBE、DBE则参与支链淀粉的形成[3]。
目前已经在水稻中发现了一系列淀粉突变体，包括粉质 (floury, flo)、糖质(sugary, su)、糯性(waxy, wx)、暗色(dull, du)、心白(whitecore, wc)、皱缩(shrunken, sh)等类型。这些突变体是研究水稻籽粒淀粉生物合成的理想材料。其中，Wx基因在1988年已被克隆出来，位于第6染色体，由13个内含子和14个外显子组成[4]，编码GBSSI蛋白。抑制Wx基因的表达,会降低GBSSI酶的活性,进而导致直链淀粉含量显著下降，表现为糯性。Satoh et al.于1981年通过N甲基N亚硝基脲(MNU)处理受精卵得到了一系列淀粉粉质突变体，命名为flo1flo5[56]。而后flo6和flo7也相继被发现和报导。其中flo4、flo5、flo2、flo7都已被克隆，flo1、flo3都已被精细定位。FLO4位于第5染色体，在flo4突变体中，胚乳内部呈现粉质的状态，但外圈是正常的，淀粉粒排列松散，直链淀粉含量下降3%左右，然而总淀粉含量基本没有变化。在flo5突变体中，种子中间部分表现为粉质性状，外层无变化，中间粉质部分的扫描电镜观察显示，淀粉颗粒更小更圆，同时淀粉粒松散排布。FLO5位于第8染色体，编码OsSSIIIa，在开花后515天表达量最大[7]。FLO2位于第4染色体，含有23个外显子和22个内含子，编码一个含有功能未知的保守序列。flo2 突变体的整个种子在长度和宽度上都比较小，且都表现为粉质，电镜观察显示胚乳中淀粉粒比野生型小，排列松散[7]。FLO1位于第5染色体，FLO3位于第4染色体，胚乳均呈现粉质，淀粉粒排列松散。本实验室利用MNU诱变获得一系列粉质突变体，并已成功克隆一个新基因，命名为FLO6。FLO6位于第3染色体长臂，编码一个植物特异的CBM48蛋白，参与水稻胚乳中复合淀粉颗粒的形成[8]。在整个种子发育过程中，flo6突变体的灌浆速率明显低于野生型。在灌浆结束后，和野生型透明的种子相比，flo6突变体呈现小而且粉质不透明的种子。利用扫描电镜观察突变体籽粒断面，还发现突变体中淀粉颗粒排列松散。目前，对于暗色基因dull1和dull3的研究较为详细。研究表明，dull1和dull3突变体的直链淀粉含量比糯米高，但是都明显低于野生型，且dull3高于dull1；这两个突变体中Wxb基因的premRNA的剪切效率都会降低，且都通过图位克隆的方法将dull1基因定位于第10染色体，将dull3定位于第2染色体的长臂上[910]。另外，ae（amyloseextender）突变体中直链淀粉含量显著增加，SSSI活性显著下降。Ae基因具有剂量效应，因为胚乳为三倍体，基因型为aeaeae的种子明显变小，种子干重只有野生型的65%，AeAeae和Aeaeae基因型的种子则略小于野生型，干重分别为野生型的99%和97%[11]。
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