水稻白条纹突变基因的初定位
本实验材料为常规粳稻品种“宁粳4号”利用EMS（甲基磺酸乙酯）诱变处理得到的白条纹突变体。多代自交后稳定遗传。突变体二叶一心期前，与野生型没有差别，二叶一心期后，突变体与野生型相比，叶子边缘、叶尖和主叶脉开始呈白条纹状，植株矮小。为了克隆突变基因，将突变体与“南京11”杂交构建F2分离群体，利用F2隐形极端个体进行基因初定位。利用Indel分子标记最终将基因初定位在水稻第3染色体短臂分子标记Indel-3-11和Indel-3-12之间，物理距离约为835kb。对水稻叶色基因的研究对于发现和理解叶绿体的发育机制及高光效育种具有一定意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 供试材料 2
1.2 实验方法 2
1.2.1 表型和部分农艺性状的调查2
1.2.2 DNA的提取2
1.2.3 聚合酶链式反应3
1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测4
2 结果与分析5
2.1 条纹叶表型和农艺性状调差结果5
2.2 初步定位分析5
3 讨论7
3.1 白条纹叶突变体的遗传分析和表型鉴定7
3.2 白条纹叶突变基因的精细定位7
3.3 应用前景7
致谢7
参考文献7
水稻白条纹突变基因的初定位
引言
水稻作为世界上食用人口最多的粮食作物，又作为植物研究的模式生物，随着水稻基因组测序工作的完成，水稻功能基因组学越来越成为大家关注的焦点。Gustaffsson［1］依据水稻叶色突变体表型将突变体分为5大主要类型，即白化、黄化、浅绿、条纹、斑点；之后，Awan 等［2］在Gustaffsson的分类基础上将水稻叶色突变体分为8种类型， 即白化、黄化、浅绿、绿白、白翠、黄绿、绿黄和条纹。随着叶色突变类型的逐渐增多，以上两种基本的分类方法并不完全适用所有突变类型，实际应用中常结合多种分类方法进行科学分类［3］。Tanya等［4］根据叶色突变的生理机理变化将
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
水稻叶色突变体分为4类，即缺总叶绿素型、缺叶绿素a型、 缺叶绿素b型和总叶绿素增加型。吴殿星等［5］根据温度对叶色标记表达的影响，将水稻叶色突变体分为3种，即高温表达型、低温表 达型和温钝型。Kusumi[6]等将叶色突变体分为2类，即光诱导型和非光诱导型。根据突变性状对个体的生长发育影响可以分为致死突变、非致死突变［7］及条件致死突变；致死 突变如苗期白化、部分黄化突变体在苗期光合作用完全受阻，幼苗仅靠种子中胚乳营养生长，待胚乳养分耗尽时植株就会死亡［8］。从叶色突变时期来看，多数水稻叶色突变体在苗期表现，部分突变体则是在生育中期表现出叶色突变，还存在叶色突变后期又恢复正常叶色的转绿型突变体［9］。虽然根据水稻表型进行分类存在一定的局限性，但也是最为直观和方便的方法，所以目前仍然以苗期叶色来确定叶色突变体的类型。
叶色突变是一种表型易于获得的突变性状，通过物理和化学等多种手段可以得到，同时也是一种观察和分离的突变性状。叶色突变在植物光合作用途径及相关基因功能研究上应用广泛。白条纹是一般较为常见且易于获得。Nagamatsu等［10］在1962年率先发现了植物白条纹叶突变体。这类突变体多为单基因隐性突变，可以发生在细胞核DNA或者质体DNA上，是研究核－质互作的理想材料［11］。在很多植物中，如水稻、拟南芥等均已发现许多白条纹叶突变体的存在。叶绿体是光合自养型植物光合作用的主要场所，可以自主复制和转录遗传信息，也是淀粉、脂类等有机大分子物质的合成场所［12－13］。叶绿素存在于植物叶绿体中，是植物进行光合作用的最主要色素。叶绿素的生物合成途径非常复杂，其中有许多代谢产物，如果因结构基因的突变而导致其中某一代谢物的合成过程受阻，就会引起叶绿素及其中间产物之间相对平衡关系发生改变，从而导致突变体的叶绿素合成受阻，使突变体的叶绿素含量降低甚至完全消失。研究表明，大多数叶色突变体表现为叶绿素含量低，其会导致植株总光合能力的下降。但也有部分研究结果表明叶色突变植株表现为耐较强的光抑制［14］和较高的光合速率。叶色突变体和产量联系紧密，对于高光效育种具有重要意义。
目前，定位、分离和克隆基因的技术多种多样，本实验所采用的研究技术是图位克隆技术（mapbased cloning）。图位克隆是随着分子标记图谱的相继建立而逐步发展起来的一种基因克隆技术，在基因定位、分离和克隆基因中得到广泛应用。根据连锁不平衡原理，同一条染色体上的DNA片段存在一定连锁关系，从而导致在减数分裂时与目的基因距离越近的染色体区段在染色体分离时发生重组交换的可能性越小，即与目的基因遗传距离越近的分子标记也会与目的基因的连锁更加紧密。染色体上分布着大量的分子标记，通过寻找与目的基因紧密连锁的分子标记，利用这些分子标记就可以初步确定目的基因在染色体上的大致位置。之后再通过染色体步移（chromosome walking）的方法逐步逼近目的基因，最终克隆目的基因。目前图位克隆已经广泛应用于水稻[15]、拟南芥[16]、棉花[17]、番茄[18]、黄瓜[19]、大豆[20]等主要农作物的基因研究中。
1 材料与方法
1．1 供试材料
实验所用白条纹叶突变体是由粳稻品种“宁粳4号”在化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）处理后获得，突变体经过多代自交除杂，其白条纹叶性状能够稳定遗传。2014年正季在大学土桥水稻实验基地将该突变体与“南京11”杂交，获得杂合群体F1；2015年南繁季将两个亲本及F1种植于水稻所海南南繁基地。F1自交获得分离群体F2，将F2用土培的方法种植于大学水稻所的人工气候室，从F2中挑选表型为条纹叶的极端个体作为连锁定位的材料。
1．2 实验方法
1．2．1 表型和部分农艺性状的调查
将水稻品种宁粳4号野生型和突变体用土培的方法种植于大学水稻所人工气候室，从出苗之后开始对比观察和记录其叶色表型，测定苗高，收获后考种。
1．2．2 DNA的提取
1．2．2 .1 实验原理
本实验采用改进的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法抽提水稻的全基因组DNA。CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在高离子强度的溶液中（>0.7mol/L NaCl），CTAB可以与蛋白质以及多聚糖形成大分子复合物，但不可以沉淀核酸，用有机溶液多次抽提，可以去除蛋白质、多糖、酚类等大量有机杂质，之后加入异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。实验中部分溶液配制如下：
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 供试材料 2
1.2 实验方法 2
1.2.1 表型和部分农艺性状的调查2
1.2.2 DNA的提取2
1.2.3 聚合酶链式反应3
1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测4
2 结果与分析5
2.1 条纹叶表型和农艺性状调差结果5
2.2 初步定位分析5
3 讨论7
3.1 白条纹叶突变体的遗传分析和表型鉴定7
3.2 白条纹叶突变基因的精细定位7
3.3 应用前景7
致谢7
参考文献7
水稻白条纹突变基因的初定位
引言
水稻作为世界上食用人口最多的粮食作物，又作为植物研究的模式生物，随着水稻基因组测序工作的完成，水稻功能基因组学越来越成为大家关注的焦点。Gustaffsson［1］依据水稻叶色突变体表型将突变体分为5大主要类型，即白化、黄化、浅绿、条纹、斑点；之后，Awan 等［2］在Gustaffsson的分类基础上将水稻叶色突变体分为8种类型， 即白化、黄化、浅绿、绿白、白翠、黄绿、绿黄和条纹。随着叶色突变类型的逐渐增多，以上两种基本的分类方法并不完全适用所有突变类型，实际应用中常结合多种分类方法进行科学分类［3］。Tanya等［4］根据叶色突变的生理机理变化将
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水稻叶色突变体分为4类，即缺总叶绿素型、缺叶绿素a型、 缺叶绿素b型和总叶绿素增加型。吴殿星等［5］根据温度对叶色标记表达的影响，将水稻叶色突变体分为3种，即高温表达型、低温表 达型和温钝型。Kusumi[6]等将叶色突变体分为2类，即光诱导型和非光诱导型。根据突变性状对个体的生长发育影响可以分为致死突变、非致死突变［7］及条件致死突变；致死 突变如苗期白化、部分黄化突变体在苗期光合作用完全受阻，幼苗仅靠种子中胚乳营养生长，待胚乳养分耗尽时植株就会死亡［8］。从叶色突变时期来看，多数水稻叶色突变体在苗期表现，部分突变体则是在生育中期表现出叶色突变，还存在叶色突变后期又恢复正常叶色的转绿型突变体［9］。虽然根据水稻表型进行分类存在一定的局限性，但也是最为直观和方便的方法，所以目前仍然以苗期叶色来确定叶色突变体的类型。
叶色突变是一种表型易于获得的突变性状，通过物理和化学等多种手段可以得到，同时也是一种观察和分离的突变性状。叶色突变在植物光合作用途径及相关基因功能研究上应用广泛。白条纹是一般较为常见且易于获得。Nagamatsu等［10］在1962年率先发现了植物白条纹叶突变体。这类突变体多为单基因隐性突变，可以发生在细胞核DNA或者质体DNA上，是研究核－质互作的理想材料［11］。在很多植物中，如水稻、拟南芥等均已发现许多白条纹叶突变体的存在。叶绿体是光合自养型植物光合作用的主要场所，可以自主复制和转录遗传信息，也是淀粉、脂类等有机大分子物质的合成场所［12－13］。叶绿素存在于植物叶绿体中，是植物进行光合作用的最主要色素。叶绿素的生物合成途径非常复杂，其中有许多代谢产物，如果因结构基因的突变而导致其中某一代谢物的合成过程受阻，就会引起叶绿素及其中间产物之间相对平衡关系发生改变，从而导致突变体的叶绿素合成受阻，使突变体的叶绿素含量降低甚至完全消失。研究表明，大多数叶色突变体表现为叶绿素含量低，其会导致植株总光合能力的下降。但也有部分研究结果表明叶色突变植株表现为耐较强的光抑制［14］和较高的光合速率。叶色突变体和产量联系紧密，对于高光效育种具有重要意义。
目前，定位、分离和克隆基因的技术多种多样，本实验所采用的研究技术是图位克隆技术（mapbased cloning）。图位克隆是随着分子标记图谱的相继建立而逐步发展起来的一种基因克隆技术，在基因定位、分离和克隆基因中得到广泛应用。根据连锁不平衡原理，同一条染色体上的DNA片段存在一定连锁关系，从而导致在减数分裂时与目的基因距离越近的染色体区段在染色体分离时发生重组交换的可能性越小，即与目的基因遗传距离越近的分子标记也会与目的基因的连锁更加紧密。染色体上分布着大量的分子标记，通过寻找与目的基因紧密连锁的分子标记，利用这些分子标记就可以初步确定目的基因在染色体上的大致位置。之后再通过染色体步移（chromosome walking）的方法逐步逼近目的基因，最终克隆目的基因。目前图位克隆已经广泛应用于水稻[15]、拟南芥[16]、棉花[17]、番茄[18]、黄瓜[19]、大豆[20]等主要农作物的基因研究中。
1 材料与方法
1．1 供试材料
实验所用白条纹叶突变体是由粳稻品种“宁粳4号”在化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）处理后获得，突变体经过多代自交除杂，其白条纹叶性状能够稳定遗传。2014年正季在大学土桥水稻实验基地将该突变体与“南京11”杂交，获得杂合群体F1；2015年南繁季将两个亲本及F1种植于水稻所海南南繁基地。F1自交获得分离群体F2，将F2用土培的方法种植于大学水稻所的人工气候室，从F2中挑选表型为条纹叶的极端个体作为连锁定位的材料。
1．2 实验方法
1．2．1 表型和部分农艺性状的调查
将水稻品种宁粳4号野生型和突变体用土培的方法种植于大学水稻所人工气候室，从出苗之后开始对比观察和记录其叶色表型，测定苗高，收获后考种。
1．2．2 DNA的提取
1．2．2 .1 实验原理
本实验采用改进的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法抽提水稻的全基因组DNA。CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在高离子强度的溶液中（>0.7mol/L NaCl），CTAB可以与蛋白质以及多聚糖形成大分子复合物，但不可以沉淀核酸，用有机溶液多次抽提，可以去除蛋白质、多糖、酚类等大量有机杂质，之后加入异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。实验中部分溶液配制如下：
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