zebularine诱导的小麦黑麦染色体变异体的选育与鉴定
研究发现zebularine能通过与甲基转移酶结合抑制DNA甲基化从而降低基因组甲基化水平，并能导致染色体结构变异。本实验室前期研究利用普通小麦辉县红-荆州黑麦双二倍体荆辉1号（AABBDDRR，2n=8x=56）作为实验材料，对zebularine浸泡处理种子M1进行表型鉴定，选择变异单株进行连续自交获得M3种子。为选育和鉴定小麦-黑麦染色体结构变异体，本文在此基础上对M3代进行GISH/FISH分析，鉴定出32个不同的染色体变异体，包括结构变异10个，其中端体1个、缺失4个和复杂变异5个；数目变异22个，荆州黑麦染色体数范围为11-15条，为构建基于小黑麦背景的变异库，提供了材料和信息。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2方法 3
2结果与分析3
2.1染色体结构变异体的鉴定3
2.2 染色体数目变异体的鉴定 5
3讨论6
3.1诱变以及变异染色体筛选新方法 6
3.2准确识别所有变异类型仍存在困难 7
致谢7
参考文献7
Zebularine诱导的小麦黑麦染色体变异体的选育与鉴定?
引言
引言：DNA甲基化是生物体在遗传变异中不可忽视的一大重要问题。在生物系统内，甲基化是经酶催化的，这种甲基化通常都涉及到重金属修饰、基因表达的调控、蛋白质功能的调节以及核糖核酸的加工。其中重金属修饰可在生物系统外发生。研究显示，甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节着基因的表达与关闭，还与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关[1]。已有研究应用DNA甲基化和去甲基化针对治愈人类一些疾病取得了重大进展。目前甲基化不仅在动物中广泛研究，在植物研究中也取得了相应进展，这也为植物染色体变异指导了新的方向。
Zebularine,中文名泽布拉尼，化学名称是1（βD呋喃核糖苷）1, 2二氢嘧啶2酮，是上世纪六十年代人工合成的一种与氮杂胞苷（5azacytidine）和脱氧氮杂胞苷（5aza2deoxycytidi
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
ne）化学结构相似的胞嘧啶类似物[2]，不溶于水或极微溶于水。研究发现它可以与转氨酶特异性结合而使转氨酶失去活性，能抑制DNA甲基化从而降低基因组甲基化水平[3]。研究表明，zebularine增进了DNA甲基转移酶的结合，从而有降低基因组甲基化水平的作用。针对zebularine抑制甲基化作用的机制开展研究，选用zebularine和另一胞苷类似物5氟脱氧胞嘧啶（5FCdR）为研究对象，人工合成嵌入zebularine和5FCdR的DNA双链dsZ和dsF，研究这两种物质与原核生物和哺乳动物中DNMT间的结合情况，结果显示：未经修饰的dsZ和dsF都能与DNMT结合形成三链复合物，且表现出包含zebularine的DNA与DNMT有更高的亲和力[4]。在进行培养的过程中，添加了胞嘧啶甲基化的甲基供体S腺苷L甲硫氨酸（AdoMet），结果发现zebularine与AdoMet和甲基转移酶间形成的复合物是可逆的，表现出热不稳定性[5]；LCMS/MS分析表明，未发现甲基化的zebularine，且CpG岛一个位置存在zebularine，临近的甲基化位点同样不发生甲基化，可以推断zebularine使甲基转移酶与DNA的结合更加稳定，从而捕获甲基转移酶，阻止其发挥作用，进而抑制DNA甲基化，降低甲基化水平[6]。
最早将zebularine应用于植物研究中的是利用观察对拟南芥生长发育的影响从而验证zebularine降低甲基化水平的效应[7]。首先，利用不同浓度的zebularine处理拟南芥，他们采用在培养基中添加20、40、80 μM zebularine发现甲基化水平从对照的6.22%分别下降到了5.56%、5.13% 和4.06%，这样则说明zebularine抑制植物的生长和降低植物的甲基化水平，并且当处理浓度越大时，植物甲基化水平越低。另外，通过观察zebularine对转录沉默基因、ddm1突变体、FWA启动子和特殊序列（CG、CHG和CHH），得知zebularine使TSI活化，使ddm1突变体异染色质染色中心弥散，免疫染色结果显示5甲基脱氧胞嘧啶并没有完全消失。由数据得知，20、40、80 μM的zebularine使FWA启动子的相对表达量分别提高为对照的2.5、3.5和6倍之多，尤其显著的是80 μM处理下使CG、CHG和CHH序列的甲基化水平分别从对照的98.3%、95.0%和75.3%下降到90.3%、58.3% 和50.0%，分别下降了8.0%、36.7%和25.3%，表明zebularine可以显著降低基因甲基化水平，重新活化沉默的基因。
用zebularine处理烟草BY2细胞表明zebularine使烟草染色体亚端部、端部和全基因组甲基化水平降低，因此而提高了端粒酶的活性[8]。另外，通过甲基化特异性酶MspI和HpaII比较9（S）（2,3二羟基丙基）腺嘌呤与zebularine降低CCGG序列甲基化水平的先后顺序而得出两种药物降低甲基化水平有着不同的模式，DHPA是从CCGG序列外部的胞嘧啶开始的，而zebularine则没有趋向性，而且zebularine降低甲基化水平依赖于时间和浓度且DHPA没有，由此可知，zebularine降低甲基化水平的效果比DHPA更好，效果更显著[9]。
利用不同浓度的zebularine对小麦大赖草染色体进行处理，观察其对根的生长影响。结果显示，低浓度和高浓度都明显抑制根的伸长生长，浓度超过5 μM根伸长就会受到明显的抑制，超过10 μM根则不再伸长，对根的伸长抑制效果随着浓度的增大而增大，处理时间越长抑制效果更显著，表明zebularine对根的伸长抑制效果依赖浓度和时间。另外，从处理过的根尖细胞中还发现了多种染色体结构变异，包括无着丝粒断片、环状染色体和双着丝粒染色体和小麦与大赖草染色体间的重组，包括插入、缺失和易位等，而且染色体变异频率和有丝分裂细胞频率还随着浓度的增加分别增加和降低，显示出zebularine处理可以明显影响根尖细胞内染色体结构的稳定性，诱发染色体结构变异[10]。
利用普通小麦辉县红荆州黑麦双二倍体荆辉1号（AABBDDRR，2n=8x=56）作为实验材料，运用不同浓度和不同处理时间，首次建立了一套利用zebularine稳定诱发染色体变异的方法，并最终得出500 μM处理24 h为较好的方案。并且完善了之前Cho的实验即不确定获得的根尖细胞的变异能否稳定遗传，采用种子浸泡的方法同时诱致种子胚芽中的细胞发生变异，从而产生可以遗传的变异类型。后来初步得出分蘖期处理也可以诱发稳定遗传的染色体变异。这项研究从M1中共检测出817条变异染色体，包括六种变异类型，将表型发生变化的21个M1植株自交产生的45个M2植株中又鉴定出4个染色体变异体，变异率为8.9%。并从214株M2植株中鉴定出38株包含染色体变异，说明zebularine诱发产生的一些染色体变异体具有传递给子代的能力[11]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2方法 3
2结果与分析3
2.1染色体结构变异体的鉴定3
2.2 染色体数目变异体的鉴定 5
3讨论6
3.1诱变以及变异染色体筛选新方法 6
3.2准确识别所有变异类型仍存在困难 7
致谢7
参考文献7
Zebularine诱导的小麦黑麦染色体变异体的选育与鉴定?
引言
引言：DNA甲基化是生物体在遗传变异中不可忽视的一大重要问题。在生物系统内，甲基化是经酶催化的，这种甲基化通常都涉及到重金属修饰、基因表达的调控、蛋白质功能的调节以及核糖核酸的加工。其中重金属修饰可在生物系统外发生。研究显示，甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节着基因的表达与关闭，还与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关[1]。已有研究应用DNA甲基化和去甲基化针对治愈人类一些疾病取得了重大进展。目前甲基化不仅在动物中广泛研究，在植物研究中也取得了相应进展，这也为植物染色体变异指导了新的方向。
Zebularine,中文名泽布拉尼，化学名称是1（βD呋喃核糖苷）1, 2二氢嘧啶2酮，是上世纪六十年代人工合成的一种与氮杂胞苷（5azacytidine）和脱氧氮杂胞苷（5aza2deoxycytidi
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
ne）化学结构相似的胞嘧啶类似物[2]，不溶于水或极微溶于水。研究发现它可以与转氨酶特异性结合而使转氨酶失去活性，能抑制DNA甲基化从而降低基因组甲基化水平[3]。研究表明，zebularine增进了DNA甲基转移酶的结合，从而有降低基因组甲基化水平的作用。针对zebularine抑制甲基化作用的机制开展研究，选用zebularine和另一胞苷类似物5氟脱氧胞嘧啶（5FCdR）为研究对象，人工合成嵌入zebularine和5FCdR的DNA双链dsZ和dsF，研究这两种物质与原核生物和哺乳动物中DNMT间的结合情况，结果显示：未经修饰的dsZ和dsF都能与DNMT结合形成三链复合物，且表现出包含zebularine的DNA与DNMT有更高的亲和力[4]。在进行培养的过程中，添加了胞嘧啶甲基化的甲基供体S腺苷L甲硫氨酸（AdoMet），结果发现zebularine与AdoMet和甲基转移酶间形成的复合物是可逆的，表现出热不稳定性[5]；LCMS/MS分析表明，未发现甲基化的zebularine，且CpG岛一个位置存在zebularine，临近的甲基化位点同样不发生甲基化，可以推断zebularine使甲基转移酶与DNA的结合更加稳定，从而捕获甲基转移酶，阻止其发挥作用，进而抑制DNA甲基化，降低甲基化水平[6]。
最早将zebularine应用于植物研究中的是利用观察对拟南芥生长发育的影响从而验证zebularine降低甲基化水平的效应[7]。首先，利用不同浓度的zebularine处理拟南芥，他们采用在培养基中添加20、40、80 μM zebularine发现甲基化水平从对照的6.22%分别下降到了5.56%、5.13% 和4.06%，这样则说明zebularine抑制植物的生长和降低植物的甲基化水平，并且当处理浓度越大时，植物甲基化水平越低。另外，通过观察zebularine对转录沉默基因、ddm1突变体、FWA启动子和特殊序列（CG、CHG和CHH），得知zebularine使TSI活化，使ddm1突变体异染色质染色中心弥散，免疫染色结果显示5甲基脱氧胞嘧啶并没有完全消失。由数据得知，20、40、80 μM的zebularine使FWA启动子的相对表达量分别提高为对照的2.5、3.5和6倍之多，尤其显著的是80 μM处理下使CG、CHG和CHH序列的甲基化水平分别从对照的98.3%、95.0%和75.3%下降到90.3%、58.3% 和50.0%，分别下降了8.0%、36.7%和25.3%，表明zebularine可以显著降低基因甲基化水平，重新活化沉默的基因。
用zebularine处理烟草BY2细胞表明zebularine使烟草染色体亚端部、端部和全基因组甲基化水平降低，因此而提高了端粒酶的活性[8]。另外，通过甲基化特异性酶MspI和HpaII比较9（S）（2,3二羟基丙基）腺嘌呤与zebularine降低CCGG序列甲基化水平的先后顺序而得出两种药物降低甲基化水平有着不同的模式，DHPA是从CCGG序列外部的胞嘧啶开始的，而zebularine则没有趋向性，而且zebularine降低甲基化水平依赖于时间和浓度且DHPA没有，由此可知，zebularine降低甲基化水平的效果比DHPA更好，效果更显著[9]。
利用不同浓度的zebularine对小麦大赖草染色体进行处理，观察其对根的生长影响。结果显示，低浓度和高浓度都明显抑制根的伸长生长，浓度超过5 μM根伸长就会受到明显的抑制，超过10 μM根则不再伸长，对根的伸长抑制效果随着浓度的增大而增大，处理时间越长抑制效果更显著，表明zebularine对根的伸长抑制效果依赖浓度和时间。另外，从处理过的根尖细胞中还发现了多种染色体结构变异，包括无着丝粒断片、环状染色体和双着丝粒染色体和小麦与大赖草染色体间的重组，包括插入、缺失和易位等，而且染色体变异频率和有丝分裂细胞频率还随着浓度的增加分别增加和降低，显示出zebularine处理可以明显影响根尖细胞内染色体结构的稳定性，诱发染色体结构变异[10]。
利用普通小麦辉县红荆州黑麦双二倍体荆辉1号（AABBDDRR，2n=8x=56）作为实验材料，运用不同浓度和不同处理时间，首次建立了一套利用zebularine稳定诱发染色体变异的方法，并最终得出500 μM处理24 h为较好的方案。并且完善了之前Cho的实验即不确定获得的根尖细胞的变异能否稳定遗传，采用种子浸泡的方法同时诱致种子胚芽中的细胞发生变异，从而产生可以遗传的变异类型。后来初步得出分蘖期处理也可以诱发稳定遗传的染色体变异。这项研究从M1中共检测出817条变异染色体，包括六种变异类型，将表型发生变化的21个M1植株自交产生的45个M2植株中又鉴定出4个染色体变异体，变异率为8.9%。并从214株M2植株中鉴定出38株包含染色体变异，说明zebularine诱发产生的一些染色体变异体具有传递给子代的能力[11]。
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