抗小麦黄花叶病主效qtlqym.nau2d的精细定位和标记开发
：小麦黄花叶病（Wheat yellow mosaic，WYM）是由小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）引起的一种土传病毒病害。一般病田减产达到10-30%，严重的则能达到70-80%。小麦黄花叶病正日益成为危害我国小麦生产的重要病害之一，目前在中国已经蔓延到长江流域和淮海流域的多个省份。通过传统的防治难以从根治小麦黄花叶病带来的影响，挖掘小麦抗WYMV基因资源和培育抗小麦黄花叶病的品种是防治该病毒病的有效手段。本研究以高感WYM的普通小麦中国春-粗山羊草2D代换系为母本，抗病品种‘仪宁小麦’为父本杂交，构建了一个包含4742个单株的F2：3群体。利用标记WMC181和WMC41为两翼标记筛选交换单株，共获得149株重组体，最后将QYm.nau-2D定位在标记WXE1338与标记WMC41之间。利用小麦EST数据库信息与粗山羊D基因数据进行比对分析，在2D染色体bin253至bin268开发了56对EST-STS标记。其中标记A3和A31能与QYm.nau-2D遗传图谱标记连锁。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1研究材料 2
1.2实验方法 3 1.2.1植物基因组DNA提取3
1.2.2 PCR反应及检测 3
1.2.3 ESTSTS标记开发4
1.2.4 分子标记扩增结果多态性分析方法4
1.2.5小麦黄花叶病分病级鉴定5
2结果与分析5
2.1交换单株筛选5
2.2标记开发7
3讨论 8
3.1 WYMV抗性鉴定 8
3.2遗传作图群体 8
3.3小麦祖先种染色体代换系在小麦遗传育种的应用 8
3.4 仪宁小麦抗WYMV QTL QYm.nau2D的精细定位 9
致谢9
参考文献9
抗小麦黄花叶病主效QTL QYm.nau2D的精细定位和标记开发
引言
小麦黄花
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
叶病（Wheat yellow mosaic，WYM）是由小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic bymovirus，WYMV）引起的一种土传病毒病害，传播介体是禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）。小麦黄花叶病已经迅速蔓延，正日益成为危害我国小麦生产的最严重的病害之一。
郭娇（2012）从‘仪宁小麦×镇9523’配置的RIL群体中选择出一个农艺性状与‘镇9523’相似、且高小麦黄花叶病的RIL家系‘RIL1114’，利用‘RIL1114×镇9523’配置的F2群体及其衍生的F2:3家系，对抗WYMV主效QTL QYm.nau2D进行了精细定位，根据标记和抗性位点重组体的个数和类型并结合连锁分析，最终将QYm.nau2D精细定位与标记2EST811和Xcfd267之间0.7cM的范围内，遗传距离分别为0.3cM和0.4cM。
陈学銮（2013）利用感黄花叶病的普通小麦粗山羊草2D代换系‘2011IP78’与‘仪宁小麦’为亲本，构建了一个新F2作图群体。田间抗性鉴定发现，该群体抗、感分离比符合3:1（χ2=0.81），表明WYMV抗性也受显性单基因控制。根据D基因组测序数据，开了271对SSR标记引物，利用F2群体，构建了新的连锁图谱，将抗性QTL也定位于2D染色体上。
本研究利用小麦的EST序列信息和模式植物短柄草的基因组信息进行比较分析，开发一系列基于PCR的分子标记，并利用构建的次级分离群体，对主效QTLQYm.nau2D区域进行进一步加密。
1 材料与方法
1.1 研究材料
‘仪宁小麦’（原称8165）是江苏省1993年4月审定通过的小麦品种，具有高抗WYMV的优异性状，另外对纹枯病、锈病感染亦较轻，并较耐寒、耐旱、耐肥、抗倒。
‘2011IP78’（DV6952）为普通小麦中国春粗山羊草2D代换系，用粗山羊草（Ae. tauschii）的2D染色体代换掉小麦品种‘中国春’的2D染色体。2011年在江苏里下河地区农科所WYMV自然发病圃中鉴定为高度感病。
2012年以感病品系‘2011I78’（DV6952）为母本，高抗品种‘仪宁小麦’为父本，进行杂交，配置杂种F1，F1自交后获得F2群体。以标记wmc41和2EST368为两翼标记，筛选杂合单株，于2014年在江苏省里下河地区农科所实验基地种植，获得F2：3次级分离群体。
图1 ‘2011I78’和‘仪宁小麦’的田间WYMV抗性表现（2015，扬州）
Fig 1 WYMV resistant of ‘2011I78’ and ‘Yining wheat’ (2015，Yangzhou)
1.2 实验方法
1.2.1植物基因组DNA提取
（1）称取3g左右的小麦叶片放入研钵中，加液氮后充分研磨至粉末状；
（2）转入2.0ml的离心管中，并加入与粉末等体积的DNA提取液混匀，65℃水浴加热振荡1h左右；
（3）取出离心管后冷却至室温，加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1）混合液，充分混匀后，室温振荡1h左右；
（4）在离心机上室温10,000rpm离心10 min；
（5）取上清液转移至另一经过灭菌的2.0ml的离心管中，加入1.5倍体积预冷的无水乙醇，放入20℃冰箱静置约1h使DNA析出；
（6）用枪头小心勾出DNA于另一经过灭菌的2.0ml的离心管中，用70%酒精漂洗23次；
（7）将提取出的DNA置于DNA真空干燥机或超净工作台上使多余酒精吹干，溶于适量TE（pH=8.0）中保存；
（8）取少量DNA原液经适度稀释后用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，与标准浓度的λDNA梯度对照，检查DNA质量和浓度。制备一套DNA工作溶液，于4℃冰箱保存备用。
附：（1）DNA提取液（1000ml）
1M TrisHCl（pH8.0） 100ml
0.5M EDTA Na（pH8.0） 100ml
5M NaCl 100ml
20% SDS 62ml
Na Bisufite (Coda S9000 sigma) 3.8g
即配即用，充分混匀后调节pH至8.0。
（2）50×TE（100ml）
TrisHCl 242g
冰HAc 57.1ml
EDTA Na2 18.6g
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1研究材料 2
1.2实验方法 3 1.2.1植物基因组DNA提取3
1.2.2 PCR反应及检测 3
1.2.3 ESTSTS标记开发4
1.2.4 分子标记扩增结果多态性分析方法4
1.2.5小麦黄花叶病分病级鉴定5
2结果与分析5
2.1交换单株筛选5
2.2标记开发7
3讨论 8
3.1 WYMV抗性鉴定 8
3.2遗传作图群体 8
3.3小麦祖先种染色体代换系在小麦遗传育种的应用 8
3.4 仪宁小麦抗WYMV QTL QYm.nau2D的精细定位 9
致谢9
参考文献9
抗小麦黄花叶病主效QTL QYm.nau2D的精细定位和标记开发
引言
小麦黄花
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叶病（Wheat yellow mosaic，WYM）是由小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic bymovirus，WYMV）引起的一种土传病毒病害，传播介体是禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）。小麦黄花叶病已经迅速蔓延，正日益成为危害我国小麦生产的最严重的病害之一。
郭娇（2012）从‘仪宁小麦×镇9523’配置的RIL群体中选择出一个农艺性状与‘镇9523’相似、且高小麦黄花叶病的RIL家系‘RIL1114’，利用‘RIL1114×镇9523’配置的F2群体及其衍生的F2:3家系，对抗WYMV主效QTL QYm.nau2D进行了精细定位，根据标记和抗性位点重组体的个数和类型并结合连锁分析，最终将QYm.nau2D精细定位与标记2EST811和Xcfd267之间0.7cM的范围内，遗传距离分别为0.3cM和0.4cM。
陈学銮（2013）利用感黄花叶病的普通小麦粗山羊草2D代换系‘2011IP78’与‘仪宁小麦’为亲本，构建了一个新F2作图群体。田间抗性鉴定发现，该群体抗、感分离比符合3:1（χ2=0.81），表明WYMV抗性也受显性单基因控制。根据D基因组测序数据，开了271对SSR标记引物，利用F2群体，构建了新的连锁图谱，将抗性QTL也定位于2D染色体上。
本研究利用小麦的EST序列信息和模式植物短柄草的基因组信息进行比较分析，开发一系列基于PCR的分子标记，并利用构建的次级分离群体，对主效QTLQYm.nau2D区域进行进一步加密。
1 材料与方法
1.1 研究材料
‘仪宁小麦’（原称8165）是江苏省1993年4月审定通过的小麦品种，具有高抗WYMV的优异性状，另外对纹枯病、锈病感染亦较轻，并较耐寒、耐旱、耐肥、抗倒。
‘2011IP78’（DV6952）为普通小麦中国春粗山羊草2D代换系，用粗山羊草（Ae. tauschii）的2D染色体代换掉小麦品种‘中国春’的2D染色体。2011年在江苏里下河地区农科所WYMV自然发病圃中鉴定为高度感病。
2012年以感病品系‘2011I78’（DV6952）为母本，高抗品种‘仪宁小麦’为父本，进行杂交，配置杂种F1，F1自交后获得F2群体。以标记wmc41和2EST368为两翼标记，筛选杂合单株，于2014年在江苏省里下河地区农科所实验基地种植，获得F2：3次级分离群体。
图1 ‘2011I78’和‘仪宁小麦’的田间WYMV抗性表现（2015，扬州）
Fig 1 WYMV resistant of ‘2011I78’ and ‘Yining wheat’ (2015，Yangzhou)
1.2 实验方法
1.2.1植物基因组DNA提取
（1）称取3g左右的小麦叶片放入研钵中，加液氮后充分研磨至粉末状；
（2）转入2.0ml的离心管中，并加入与粉末等体积的DNA提取液混匀，65℃水浴加热振荡1h左右；
（3）取出离心管后冷却至室温，加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1）混合液，充分混匀后，室温振荡1h左右；
（4）在离心机上室温10,000rpm离心10 min；
（5）取上清液转移至另一经过灭菌的2.0ml的离心管中，加入1.5倍体积预冷的无水乙醇，放入20℃冰箱静置约1h使DNA析出；
（6）用枪头小心勾出DNA于另一经过灭菌的2.0ml的离心管中，用70%酒精漂洗23次；
（7）将提取出的DNA置于DNA真空干燥机或超净工作台上使多余酒精吹干，溶于适量TE（pH=8.0）中保存；
（8）取少量DNA原液经适度稀释后用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，与标准浓度的λDNA梯度对照，检查DNA质量和浓度。制备一套DNA工作溶液，于4℃冰箱保存备用。
附：（1）DNA提取液（1000ml）
1M TrisHCl（pH8.0） 100ml
0.5M EDTA Na（pH8.0） 100ml
5M NaCl 100ml
20% SDS 62ml
Na Bisufite (Coda S9000 sigma) 3.8g
即配即用，充分混匀后调节pH至8.0。
（2）50×TE（100ml）
TrisHCl 242g
冰HAc 57.1ml
EDTA Na2 18.6g
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