利用vigs体系快速鉴定小麦tarlk基因在抗赤霉病中的功能1
由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum，F.g)引起的小麦赤霉病(Fusarium Head Blight，FHB)是小麦的主要病害，严重影响小麦产量和品质。研究禾谷镰刀菌和小麦宿主互作的分子机制，发掘致病或抗病相关基因，对赤霉病的防治有着重要意义。病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)是一种通过抑制基因转录研究植物基因功能的快速方法，以大麦条纹花叶病毒（Barley stripe mosaic virus,BSMV）改造的VIGS(Virus induced gene silencing)载体在小麦中能够介导基因沉默，因此在小麦基因功能鉴定中得到广泛应用。本研究尝试构建小麦的穗部VIGS体系，通过基因沉默的方法研究定位于抗赤霉病主效QTL Fhb1区域的一个类受体蛋白激酶基因 TaRLK在抗赤霉病中的功能，结果显示，与对照相比，经沉默后，TaRLK基因的表达量下降了80%以上，基因沉默的植株其病小穗率提高了近5倍，感病性显著提高,，初步鉴定该基因在抗赤霉病中发挥作用。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 植物材料 2
1.2 赤霉菌菌株 2
1.3 赤霉菌的接种和取样 3
1.4 VIGS病毒载体 3
1.5 VIGS流程 3
1.5.1 携带目标基因片段的重组质粒的构建及阳性克隆的筛选 3
1.5.2 质粒提取 3
1.5.3 载体的线性化 3
1.5.4 酶切产物的回收 3
1.5.5 体外转录反应 3
1.5.6 转录产物的混合 4
1.5.7 给植株接种转录产物 4
1.5.8 病毒表型的观察和沉默效率的检测 4
1.5.9 QPCR实验室鉴定VIGS对目标基因TaRLK的沉默效果。 4
2 结果与分析 4
2．1 VIGS重组载体的构建 4
2．2 载体的线性化 5
2．3 体外转录 5 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
2．4 病毒接种与赤霉菌接种 5
2．5 基因沉默效果鉴定 6
2．6 赤霉病发病情况统计 6
3 讨论 8
致谢 8
参考文献： 9
利用VIGS体系快速鉴定小麦TaRLK基因在抗赤霉病中的功能
引言
引言
小麦作为世界上种植面积最大、总产量最高的粮食作物之一，其高产、稳产对于保障粮食安全具有重要的意义[1]。小麦赤霉病由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum，F.g)引起，一般在开花期极容易感染赤霉病[2]，不仅会极大地降低小麦产量，而且真菌分泌的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)等毒素积累在小麦籽粒中会降低小麦的品质，甚至造成人畜中毒[3]。因此，研究禾谷镰刀菌和小麦宿主互作的分子机制，以及宿主小麦细胞内病程相关基因的互作分子机制，探寻一些致病或抗病的相关基因，从而加强对赤霉病的防治便有着重要意义[4]。植物蛋白激酶共分为六类亚家族，分别为类受体蛋白激酶、钙依赖蛋白激酶、促分裂原蛋白激酶、钙 / 钙调素依赖蛋白激酶、核糖体蛋白激酶和转录调控蛋白激酶[5]，对于植物类受体蛋白激酶(RLKs)家族的研究可以对揭示植物抗病作用及信号转导机制，分析植物对体内、外刺激反应的机制，找到植物感受体内、外信号的受体等有很大帮助[6]。
早在20世纪2030年代期间，人们就发现感染了病毒温和株系的植株可以抵御随后的温和株系及与其亲源关系相近的强毒株系病毒的侵染，即交叉保护现象[7]。进一步研究发现，交叉保护现象是由于病毒诱导产生了ＲＮＡ沉默，使植株产生了对该病毒的抗性，即病毒诱导的基因沉默。后来在转基因植株中出现了类似的现象，即病毒接种的初期，病毒正常增殖，接种叶片表现出被病毒感染的症状。但随着病毒在植株中的系统扩散，植株的新生叶片中虽仅含有少量的转入基因，但表现出对该病毒的抗性[8]。VIGS技术的原理基于寄主细胞与病毒之间的互作。如果将待检测功能目标基因的外显子片段连接到病毒载体上并导入植物体内,植物在抑制病毒基因组转录产物表达的同时,也将病毒载体上目标基因转录产物切割成小干扰RNA,小干扰RNA可能通过胞间连丝(Plasmodesmata)和韧皮部(Phloem)转运系统进行细胞间转移和整个植株的长距离运输,并迅速沉默植物体内与目标基因具有一定同源性的内源基因,从而引起植物体目标基因功能的丧失。通过靶基因沉默后植物表型的评估,进而研究该基因的功能,并可进行大规模功能基因的筛选。这就是病毒诱导的基因沉默技术[9]。本实验便是利用VIGS技术鉴定一个抗赤霉病主效QTL候选基因TaRLK（类受体蛋白激酶）的抗赤霉病功能。
1 材料与方法
1.1 植物材料
抗赤霉病小麦品种苏麦3号。
1.2 赤霉菌菌株
本研究所用的菌株包括长江中下游地区强致病力菌株Fg0609，菌株为F0609由江苏省农业科学院生物技术研究所张旭研究员提供以上菌株，由本大学作物遗传与种质创新国家重点实验保存。
1.3 赤霉菌的接种和取样
将实验所用苏麦3号种植于室内温室，待扬花期时，用单花滴注接种法接种赤霉菌株Fg0609，每个穗子接种2朵小花，喷雾保湿3天，保证诱导充分。在诱导后24h取接种小穗，迅速置于液氮中，提取穗组织总RNA。将RNA样品反转录(Reverse transcription, RT)获得cDNA，以备后续实验。
1.4 VIGS病毒载体
本研究选用的是常用的RNA病毒载体中的大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus,BSMV)。包括BSMV病毒载体α、β、γ，以及前人沉默植物内源八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因构建的VIGS载体,γPDS。其中载体α、β是在沉默中起主要作用，载体γ中则携带需要鉴定的TaRLK基因，同时以不携带目标基因的载体γ（γ空）作为其对照来辅助验证该基因的抗赤霉病功能。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 植物材料 2
1.2 赤霉菌菌株 2
1.3 赤霉菌的接种和取样 3
1.4 VIGS病毒载体 3
1.5 VIGS流程 3
1.5.1 携带目标基因片段的重组质粒的构建及阳性克隆的筛选 3
1.5.2 质粒提取 3
1.5.3 载体的线性化 3
1.5.4 酶切产物的回收 3
1.5.5 体外转录反应 3
1.5.6 转录产物的混合 4
1.5.7 给植株接种转录产物 4
1.5.8 病毒表型的观察和沉默效率的检测 4
1.5.9 QPCR实验室鉴定VIGS对目标基因TaRLK的沉默效果。 4
2 结果与分析 4
2．1 VIGS重组载体的构建 4
2．2 载体的线性化 5
2．3 体外转录 5 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
2．4 病毒接种与赤霉菌接种 5
2．5 基因沉默效果鉴定 6
2．6 赤霉病发病情况统计 6
3 讨论 8
致谢 8
参考文献： 9
利用VIGS体系快速鉴定小麦TaRLK基因在抗赤霉病中的功能
引言
引言
小麦作为世界上种植面积最大、总产量最高的粮食作物之一，其高产、稳产对于保障粮食安全具有重要的意义[1]。小麦赤霉病由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum，F.g)引起，一般在开花期极容易感染赤霉病[2]，不仅会极大地降低小麦产量，而且真菌分泌的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)等毒素积累在小麦籽粒中会降低小麦的品质，甚至造成人畜中毒[3]。因此，研究禾谷镰刀菌和小麦宿主互作的分子机制，以及宿主小麦细胞内病程相关基因的互作分子机制，探寻一些致病或抗病的相关基因，从而加强对赤霉病的防治便有着重要意义[4]。植物蛋白激酶共分为六类亚家族，分别为类受体蛋白激酶、钙依赖蛋白激酶、促分裂原蛋白激酶、钙 / 钙调素依赖蛋白激酶、核糖体蛋白激酶和转录调控蛋白激酶[5]，对于植物类受体蛋白激酶(RLKs)家族的研究可以对揭示植物抗病作用及信号转导机制，分析植物对体内、外刺激反应的机制，找到植物感受体内、外信号的受体等有很大帮助[6]。
早在20世纪2030年代期间，人们就发现感染了病毒温和株系的植株可以抵御随后的温和株系及与其亲源关系相近的强毒株系病毒的侵染，即交叉保护现象[7]。进一步研究发现，交叉保护现象是由于病毒诱导产生了ＲＮＡ沉默，使植株产生了对该病毒的抗性，即病毒诱导的基因沉默。后来在转基因植株中出现了类似的现象，即病毒接种的初期，病毒正常增殖，接种叶片表现出被病毒感染的症状。但随着病毒在植株中的系统扩散，植株的新生叶片中虽仅含有少量的转入基因，但表现出对该病毒的抗性[8]。VIGS技术的原理基于寄主细胞与病毒之间的互作。如果将待检测功能目标基因的外显子片段连接到病毒载体上并导入植物体内,植物在抑制病毒基因组转录产物表达的同时,也将病毒载体上目标基因转录产物切割成小干扰RNA,小干扰RNA可能通过胞间连丝(Plasmodesmata)和韧皮部(Phloem)转运系统进行细胞间转移和整个植株的长距离运输,并迅速沉默植物体内与目标基因具有一定同源性的内源基因,从而引起植物体目标基因功能的丧失。通过靶基因沉默后植物表型的评估,进而研究该基因的功能,并可进行大规模功能基因的筛选。这就是病毒诱导的基因沉默技术[9]。本实验便是利用VIGS技术鉴定一个抗赤霉病主效QTL候选基因TaRLK（类受体蛋白激酶）的抗赤霉病功能。
1 材料与方法
1.1 植物材料
抗赤霉病小麦品种苏麦3号。
1.2 赤霉菌菌株
本研究所用的菌株包括长江中下游地区强致病力菌株Fg0609，菌株为F0609由江苏省农业科学院生物技术研究所张旭研究员提供以上菌株，由本大学作物遗传与种质创新国家重点实验保存。
1.3 赤霉菌的接种和取样
将实验所用苏麦3号种植于室内温室，待扬花期时，用单花滴注接种法接种赤霉菌株Fg0609，每个穗子接种2朵小花，喷雾保湿3天，保证诱导充分。在诱导后24h取接种小穗，迅速置于液氮中，提取穗组织总RNA。将RNA样品反转录(Reverse transcription, RT)获得cDNA，以备后续实验。
1.4 VIGS病毒载体
本研究选用的是常用的RNA病毒载体中的大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus,BSMV)。包括BSMV病毒载体α、β、γ，以及前人沉默植物内源八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因构建的VIGS载体,γPDS。其中载体α、β是在沉默中起主要作用，载体γ中则携带需要鉴定的TaRLK基因，同时以不携带目标基因的载体γ（γ空）作为其对照来辅助验证该基因的抗赤霉病功能。
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