温度调控拟南芥种子萌发的全基因组关联分析
：拟南芥是植物研究的模式植株，对拟南芥基因功能的研究，为其它植物基因功能研究提供参照。随着全球气候变暖，高温成了制约植物生长发育的主要非生物胁迫因子之一。分析拟南芥的耐热机制，将为实际生产中减轻植物高温伤害提供指导，对抗热胁迫基础理论的研究具有重要理论意义。本研究以77份拟南芥自然变种为材料，通过在高温条件下发芽率测定，应用全基因组关联分析（Genome-Wide Associated study，GWAS），定位到3个与拟南芥种子萌发耐热性可能相关的QTL（quantitative trait locus）。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1 供试材料 3
1.1.1 种子来源及信息 3
1.1.2 实验室种植 3
1.1.3 主要试剂和仪器 3
1.1.4 1/2MS培养基 3
1.2 培养方法 3
1.2.1 培养皿点种和发芽培养 3
1.2.2 种子发芽率测定 3
1.3 全基因组关联分析 3
1.4 关联SNPs候选基因搜索 3
2 结果与分析 4
2.1 实验处理条件的确定 4
2.1.1 处理温度设定 4
2.1.2 统计时间确定 4
2．2 不同温度下拟南芥萌发差异 5
2.3 萌发耐热性表型SNP标记的全基因组关联分析 5
2.3.1 QTL初步定位 5
2.3.2 候选基因筛选 6
3 讨论 6
3.1 萌发耐热性全基因组关联分析的检测 6
3.2 遗传结构对GWAS的影响 6
3.3 全基因组关联分析的不足 7
3.4 后基因组关联研究的机遇 7
致谢 7
参考文献 8
温度调控拟南芥种子萌发的全基因组关联分析
引言
引言：在农
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
业生产中温度逆境是限制其地域分布的主要因子，是植物生长发育过程中最常见也是影响最严重的逆境因子之一。植物生长的最适温度为1528℃，高于或低于此温度范围都会引发植物开花和结实的不正常[1]。近年来全球性温室效应不断加剧，据预测我国各地的增温幅度将明显高于全球，整个农业将面临严重挑战[2]。植物为了适应外界环境如温度的变化，在进化的过程中一直存在着持续的自然变异，这些经过长期的自然选择的变异群体是我们研究植物适应外界环境变化的良好材料。近年来，对植物高温胁迫响应机理的研究已经成为生命科学研究中的热点领域，研究模式植物拟南芥的高温伤害及其生理生化基础，对于研究其他植物的耐热机制具有重要的意义。
拟南芥（Arabidopsis thaliana）属十字花科，与白菜、油菜、甘蓝等经济作物同属一科。在自然界中主要分布于温带，集中在欧洲地区，在东非、亚洲大陆、日本也都有分布，一般生长在野外干燥土壤中。现在从世界各地共收集到>2000多个拟南芥生态型，这些生态型在形态发育、生理反应方面存在很大差异。在拟南芥的众生态型中实验室最常用的三种是Landsberg erecta（Ler）、Columbia（Col）、Wassilewskija（Ws），Col生态型用于拟南芥的全基因组测序，于2000年完成，成为植物界第一个被完整测序的物种[3]。
拟南芥作为一种模式植物，具有其它植物无法替代的优点：（1）生长周期短，实验室常用的许多品系，从萌芽到种子成熟，大约为6个星期；（2）拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的，125 Mbp（水稻基因组430 Mb，玉米基因组4 500 Mb），约25 900个基因；（3）基因组仅有5条染色体，113亿个碱基对，其染色体数量是玉米的1/20；（4）具有双子叶植物的所有特性，整个生命周期同样经过细胞的分裂、生长发育、分化、衰老、死亡等一系列生物学现象；（5）拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得大量的突变体和基因组资源；（6）植株小，可在有限的空间内可大量种植，收获大量的种子[4]。通过对拟南芥基因组的研究，推动了许多其它植物相关基因的研究。这些优点使拟南芥成为遗传研究的模式生物。
植物进化过程中形成许多应对高温逆境的机制，包括基础耐热性和获得耐热性[5]。当植物受到高温胁迫时一些基因被激活，从而导致一些代谢物和蛋白水平的增加，这些基因中有些可能会保护植物免受高温胁迫的伤害，有些可能会激活某些特定基因的表达从而增强植物的耐热性。目前，已经克隆与植物耐热性有关的基因主要分为热激蛋白（HSPs heat shock proteins）、热激转录因子（HSFs，heat stress transcription factors）与稳定性抗氧化和激素相关的基因等[6]。
近年来的研究揭示了几种能增强植物耐热性的途径，为植物耐热性研究提供了参考。其中大致可分为3条途径：其一，高温导致植物细胞膜系统流动性加强和细胞骨架的重组，造成胞外钙离子的涌入，而钙离子的变化激活钙依赖蛋白激酶（CDPK，calcium
dependent protein kinase）的活性，进一步诱导了促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK，mitogenactivated protein kinases），再将信号传递到细胞核，诱导热激基因的表达；其二，高温导致胞质内蛋白质变性，变性的蛋白质聚集，进而引起热激蛋白Hsp70/90和热激转录因子HsfA/B的积累，热激蛋白使变性的蛋白质复性，具有分子伴侣的功能，有助于高温下保持和恢复蛋白质的活性结构。其中HSP70与抗热性的关系最为突出热激转录因子HsfA/B进入细胞核与热激元件结合，诱导热激基因的表达；其三，热胁迫引起活性氧类物质的生成，由此激发活性氧类物质介导的信号传导途径通过某种未知途径将信号传至细胞核内，同热激基因的其他元件相结合，诱导热激基因的表达[7]。
近年来，随着高通量基因型分型技术的发展和关联分析理论的不断完善，植物中全基因组关联分析（GWAS）的研究越来越多。关联分析（Association Analysis）又称关联定位（Association Mapping），是作用于同一染色体或者不同染色体上不同位点等位基因之间的连锁不平衡，从而进行性状与标记的相关性分析。主要有基于候选基因（candidate gene）的关联分析和基于全基因组（genomewide）的关联分析。候选基因关联分析（Candidate gene association study，CGAS）是建立在对目标性状代谢网络遗传分析的基础上，从而推断有哪些候选基因可能参与目标性状的调控[8]。全基因组关联分析（Genomewide association study，GWAS）是一种对全基因组范围内常见遗传变异（单核苷酸多态性和拷贝数）总体关联分析的方法。全基因组关联分析需要选择一定数量覆盖全基因组的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）对研究的群体进行全基因组扫描，然后将得到的分子数据与表型数据进行关联分析类似于基于候选基因的关联分析，若某个SNP与表型性状显著关联，那么这个SNP与表型数据存在协同变异的关系。因此，GWAS是一种综合系统的分析方法，除了检测基因组SNP之外，还需要考虑种质材料的代表性材料的群体结构和LD分析表型的选择与鉴定以及表型与基因型的关联分析模型的选择等[9]。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1 供试材料 3
1.1.1 种子来源及信息 3
1.1.2 实验室种植 3
1.1.3 主要试剂和仪器 3
1.1.4 1/2MS培养基 3
1.2 培养方法 3
1.2.1 培养皿点种和发芽培养 3
1.2.2 种子发芽率测定 3
1.3 全基因组关联分析 3
1.4 关联SNPs候选基因搜索 3
2 结果与分析 4
2.1 实验处理条件的确定 4
2.1.1 处理温度设定 4
2.1.2 统计时间确定 4
2．2 不同温度下拟南芥萌发差异 5
2.3 萌发耐热性表型SNP标记的全基因组关联分析 5
2.3.1 QTL初步定位 5
2.3.2 候选基因筛选 6
3 讨论 6
3.1 萌发耐热性全基因组关联分析的检测 6
3.2 遗传结构对GWAS的影响 6
3.3 全基因组关联分析的不足 7
3.4 后基因组关联研究的机遇 7
致谢 7
参考文献 8
温度调控拟南芥种子萌发的全基因组关联分析
引言
引言：在农
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
业生产中温度逆境是限制其地域分布的主要因子，是植物生长发育过程中最常见也是影响最严重的逆境因子之一。植物生长的最适温度为1528℃，高于或低于此温度范围都会引发植物开花和结实的不正常[1]。近年来全球性温室效应不断加剧，据预测我国各地的增温幅度将明显高于全球，整个农业将面临严重挑战[2]。植物为了适应外界环境如温度的变化，在进化的过程中一直存在着持续的自然变异，这些经过长期的自然选择的变异群体是我们研究植物适应外界环境变化的良好材料。近年来，对植物高温胁迫响应机理的研究已经成为生命科学研究中的热点领域，研究模式植物拟南芥的高温伤害及其生理生化基础，对于研究其他植物的耐热机制具有重要的意义。
拟南芥（Arabidopsis thaliana）属十字花科，与白菜、油菜、甘蓝等经济作物同属一科。在自然界中主要分布于温带，集中在欧洲地区，在东非、亚洲大陆、日本也都有分布，一般生长在野外干燥土壤中。现在从世界各地共收集到>2000多个拟南芥生态型，这些生态型在形态发育、生理反应方面存在很大差异。在拟南芥的众生态型中实验室最常用的三种是Landsberg erecta（Ler）、Columbia（Col）、Wassilewskija（Ws），Col生态型用于拟南芥的全基因组测序，于2000年完成，成为植物界第一个被完整测序的物种[3]。
拟南芥作为一种模式植物，具有其它植物无法替代的优点：（1）生长周期短，实验室常用的许多品系，从萌芽到种子成熟，大约为6个星期；（2）拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的，125 Mbp（水稻基因组430 Mb，玉米基因组4 500 Mb），约25 900个基因；（3）基因组仅有5条染色体，113亿个碱基对，其染色体数量是玉米的1/20；（4）具有双子叶植物的所有特性，整个生命周期同样经过细胞的分裂、生长发育、分化、衰老、死亡等一系列生物学现象；（5）拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得大量的突变体和基因组资源；（6）植株小，可在有限的空间内可大量种植，收获大量的种子[4]。通过对拟南芥基因组的研究，推动了许多其它植物相关基因的研究。这些优点使拟南芥成为遗传研究的模式生物。
植物进化过程中形成许多应对高温逆境的机制，包括基础耐热性和获得耐热性[5]。当植物受到高温胁迫时一些基因被激活，从而导致一些代谢物和蛋白水平的增加，这些基因中有些可能会保护植物免受高温胁迫的伤害，有些可能会激活某些特定基因的表达从而增强植物的耐热性。目前，已经克隆与植物耐热性有关的基因主要分为热激蛋白（HSPs heat shock proteins）、热激转录因子（HSFs，heat stress transcription factors）与稳定性抗氧化和激素相关的基因等[6]。
近年来的研究揭示了几种能增强植物耐热性的途径，为植物耐热性研究提供了参考。其中大致可分为3条途径：其一，高温导致植物细胞膜系统流动性加强和细胞骨架的重组，造成胞外钙离子的涌入，而钙离子的变化激活钙依赖蛋白激酶（CDPK，calcium
dependent protein kinase）的活性，进一步诱导了促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK，mitogenactivated protein kinases），再将信号传递到细胞核，诱导热激基因的表达；其二，高温导致胞质内蛋白质变性，变性的蛋白质聚集，进而引起热激蛋白Hsp70/90和热激转录因子HsfA/B的积累，热激蛋白使变性的蛋白质复性，具有分子伴侣的功能，有助于高温下保持和恢复蛋白质的活性结构。其中HSP70与抗热性的关系最为突出热激转录因子HsfA/B进入细胞核与热激元件结合，诱导热激基因的表达；其三，热胁迫引起活性氧类物质的生成，由此激发活性氧类物质介导的信号传导途径通过某种未知途径将信号传至细胞核内，同热激基因的其他元件相结合，诱导热激基因的表达[7]。
近年来，随着高通量基因型分型技术的发展和关联分析理论的不断完善，植物中全基因组关联分析（GWAS）的研究越来越多。关联分析（Association Analysis）又称关联定位（Association Mapping），是作用于同一染色体或者不同染色体上不同位点等位基因之间的连锁不平衡，从而进行性状与标记的相关性分析。主要有基于候选基因（candidate gene）的关联分析和基于全基因组（genomewide）的关联分析。候选基因关联分析（Candidate gene association study，CGAS）是建立在对目标性状代谢网络遗传分析的基础上，从而推断有哪些候选基因可能参与目标性状的调控[8]。全基因组关联分析（Genomewide association study，GWAS）是一种对全基因组范围内常见遗传变异（单核苷酸多态性和拷贝数）总体关联分析的方法。全基因组关联分析需要选择一定数量覆盖全基因组的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）对研究的群体进行全基因组扫描，然后将得到的分子数据与表型数据进行关联分析类似于基于候选基因的关联分析，若某个SNP与表型性状显著关联，那么这个SNP与表型数据存在协同变异的关系。因此，GWAS是一种综合系统的分析方法，除了检测基因组SNP之外，还需要考虑种质材料的代表性材料的群体结构和LD分析表型的选择与鉴定以及表型与基因型的关联分析模型的选择等[9]。
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