稻瘟病菌外泌基因moprs的功能分析
摘要：在本实验室之前的研究中，发现稻瘟病菌中SNARE蛋白MoSyn8调控稻瘟病菌的生长、产孢及致病性，为了进一步了解MoSyn8的生物学功能，我们收集了突变体及野生型的外泌蛋白，通过双向电泳和质谱分析，找到了12个差异表达蛋白，对其进行基因敲除，发现MoPRS基因调控稻瘟病菌营养菌丝的生长，该基因突变体分生孢子的穿透和侵染菌丝的扩展能力下降，从而导致病原物对寄主的致病力下降，但是对分生孢子和附着胞的形成并无影响。通过侵染阶段亚细胞定位观察，发现该基因定位与BIC(biotrophic interfacial complex)结构，推断MoPrs可能是一个细胞质效应分子。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1 PCR引物序列3
1.2 供试菌株及培养条件3
1.3 MoPRS基因载体构建及敲除突变体的获得3
1.3.1 MoPRS基因敲除载体的构建3
1.3.2 MoPRS基因敲除突变体的筛选及验证3
1.4 MoPRS敲除突变体的基因互补实验4
1.5 酵母转化4
1.6 MoPRS基因敲除突变体不同培养基条件下生长速率测定4
1.7 MoPRS敲除突变体产孢和附着胞形成测定5
1.8 MoPRS敲除突变体致病力测定5
1.9 MoPRS敲除突变体侵入分析5
2 结果与分析6
2.1 利用同源重组获得突变体6
2.2 MoPRS敲除突变体生长减慢6
2.3 MoPRS敲除突变体的产孢量、萌发率及附着胞形成率不变化7
2.4 MoPRS敲除突变体致病力下降7
2.5 MoPRS敲除突变体侵染菌丝扩展能力下降8
2.6 MoPRS参与对外界胁迫的应答9
2.7 MoPrs侵染阶段的荧光定位10
3 讨论10
致谢10
参考文献11
稻瘟病菌外泌基因MoPRS的功能分析
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
引言：稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引发的稻瘟病是水稻上最重要的病害之一，与水稻纹枯病、水稻稻曲病、水稻病毒病并称水稻四大病害，该病分布广泛，已经严重威胁着世界粮食生产安全[1]，我国南北稻区也均有发生。在病害流行地区，一般减产10%～20%，严重时可达40%～50%，特别重的田块甚至颗粒无收。目前，防治稻瘟病主要采用选育和利用抗病丰产优质良种，但由于稻瘟病菌小种在大田中非常容易发生变异，抗病品种种植35年之后，就降低甚至丧志对稻瘟病的抗性；另一方面，防治稻瘟病还可以采用化学药剂处理的方法，但目前为止，对稻瘟病有防效的药剂主要为三环唑类，因此设计并开发新的抗菌靶标尤为重要。同时，稻瘟病菌的致病机制具有普适性，很多植物病原菌都具有相似的模式，因此，研究稻瘟病菌的致病机制可以为更好的防治稻瘟病提供理论基础，而且对其它植物病原菌的致病机制研究具有借鉴意义。稻瘟病菌侵染水稻的过程中，需要经历一系列复杂而有效的过程。水稻为了抵御稻瘟病菌的侵染，同样进化出了许多防护措施。为了更好的防治稻瘟病，需要对两者发生的变化进行系统而深入的研究，水稻和稻瘟病菌的全基因组序列于2002年和2005年公布，全序列的公布对研究稻瘟病菌的致病机理和与水稻的互作模式提供了良好的契机，大量研究成果的发表，大大推动了对稻瘟病菌的研究进程。
稻瘟病菌以一种典型方式侵染水稻。分生孢子接触到水稻叶片后，萌发成芽管，随后芽管停止生长，顶端开始弯曲并逐步膨大形成附着胞[2]。附着胞完全成熟后，会在内部积聚并维持巨大的膨压，通过挤压产生侵入钉，侵入钉可以穿透水稻表皮，侵入到植物细胞内部，和细胞膜形成一个空腔结构[3]。侵入钉侵入植物细胞后，和水稻持续一段共生状态，随后分化成侵染菌丝，并迅速扩展到整个细胞以及临近细胞，接着叶片出现病斑。这些病斑在合适的条件下，会重新产生分生孢子梗，接着分化产生大量的分生孢子，从病斑中释放出来，这些新释放的孢子可以被潮湿的空气带到附近的水稻植株上，开始新一轮的侵染[4]。后期稻瘟病菌以菌丝体和分生孢子的形式在病稻草或谷粒上越冬，成为下一年的侵染源。
稻瘟病菌侵染水稻符合基因对基因假说。植物抗病防御信号调控途径可分为两种，依赖于植物病原物分子识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)激活的信号途径[5]和通过效应蛋白(Effectors)激活的信号途径[6]。在植物与病原物的早期进化过程中，病原物通过分泌病原物相关分子(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs) 破坏植物细胞，导致感病；另一方面，植物进化出了一类PRRs分子受体，通过识别特异性病原物分子，激发植物抗病信号以抑制病原物侵染。这种基于植物病原物分子受体——病原物分子的识别模式被称为病原物分子诱导的抗病反应(PAMPtriggered immunity,PTI)。针对植物的这种抗病反应，病原物进化出新的侵染机制以克服或者抑制植物病原物分子诱导的抗性，此类系统通过分泌效应蛋白(Effectors)直接进入植物细胞内，破坏植物体而导致感病，因此被称为效应蛋白诱导的感病性(Effector triggered susceptibility,ETS)。相应地，植物也进化出了相应的抗性基因(Resistance genes)，通过直接或间接的相互作用识别效应蛋白，并激发强烈的抗病反应，故被称为效应蛋白诱导的抗病性(Effectortriggeredimmunity，ETI) 。稻瘟病菌的效应分子主要通过两种方式进入到植物细胞中，细胞质效应分子，如 Pwl1, Pwl2, Bas2, and AvrPizT，通过活体营养界面复合体（BIC）传递到植物细胞内，BIC是有寄主的细胞质膜形成的特殊结构；另一种效应分子，质外体效应分子，如Bas4，主要积聚在侵染菌丝和寄主包膜（EIHM）之间[7]。
SNARE蛋白在细胞内的膜泡融合过程中起着重要的作用[8]。它们通过链式结构的SNARE结构域锚定在膜上。在不同的膜结构上形成的四螺旋束可以牵引这些膜进入临近的结构中启动膜的融合[9,10]。SNARE蛋白Syn8在酵母中主要参与晚期内含体到高尔基体转运过程。实验室在之前的研究中，已经从稻瘟病菌中克隆了酵母中SYN8同源基因MoSYN8，并采用基因敲除的方法对其生物学功能进行研究。而本研究主内容是，通过对比MoSYN8突变体与野生型Guy11外泌蛋白的双向电泳图（图1中的A9点），选取其中存在灰度差异的一种外泌蛋白MoPrs，对其进行基因敲除并进行生物学研究分析。
图1 MoSYN8突变体与野生型Guy11外泌蛋白的双向电泳图
1 材料与方法
1.1 PCR引物序列
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1 PCR引物序列3
1.2 供试菌株及培养条件3
1.3 MoPRS基因载体构建及敲除突变体的获得3
1.3.1 MoPRS基因敲除载体的构建3
1.3.2 MoPRS基因敲除突变体的筛选及验证3
1.4 MoPRS敲除突变体的基因互补实验4
1.5 酵母转化4
1.6 MoPRS基因敲除突变体不同培养基条件下生长速率测定4
1.7 MoPRS敲除突变体产孢和附着胞形成测定5
1.8 MoPRS敲除突变体致病力测定5
1.9 MoPRS敲除突变体侵入分析5
2 结果与分析6
2.1 利用同源重组获得突变体6
2.2 MoPRS敲除突变体生长减慢6
2.3 MoPRS敲除突变体的产孢量、萌发率及附着胞形成率不变化7
2.4 MoPRS敲除突变体致病力下降7
2.5 MoPRS敲除突变体侵染菌丝扩展能力下降8
2.6 MoPRS参与对外界胁迫的应答9
2.7 MoPrs侵染阶段的荧光定位10
3 讨论10
致谢10
参考文献11
稻瘟病菌外泌基因MoPRS的功能分析
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
引言：稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引发的稻瘟病是水稻上最重要的病害之一，与水稻纹枯病、水稻稻曲病、水稻病毒病并称水稻四大病害，该病分布广泛，已经严重威胁着世界粮食生产安全[1]，我国南北稻区也均有发生。在病害流行地区，一般减产10%～20%，严重时可达40%～50%，特别重的田块甚至颗粒无收。目前，防治稻瘟病主要采用选育和利用抗病丰产优质良种，但由于稻瘟病菌小种在大田中非常容易发生变异，抗病品种种植35年之后，就降低甚至丧志对稻瘟病的抗性；另一方面，防治稻瘟病还可以采用化学药剂处理的方法，但目前为止，对稻瘟病有防效的药剂主要为三环唑类，因此设计并开发新的抗菌靶标尤为重要。同时，稻瘟病菌的致病机制具有普适性，很多植物病原菌都具有相似的模式，因此，研究稻瘟病菌的致病机制可以为更好的防治稻瘟病提供理论基础，而且对其它植物病原菌的致病机制研究具有借鉴意义。稻瘟病菌侵染水稻的过程中，需要经历一系列复杂而有效的过程。水稻为了抵御稻瘟病菌的侵染，同样进化出了许多防护措施。为了更好的防治稻瘟病，需要对两者发生的变化进行系统而深入的研究，水稻和稻瘟病菌的全基因组序列于2002年和2005年公布，全序列的公布对研究稻瘟病菌的致病机理和与水稻的互作模式提供了良好的契机，大量研究成果的发表，大大推动了对稻瘟病菌的研究进程。
稻瘟病菌以一种典型方式侵染水稻。分生孢子接触到水稻叶片后，萌发成芽管，随后芽管停止生长，顶端开始弯曲并逐步膨大形成附着胞[2]。附着胞完全成熟后，会在内部积聚并维持巨大的膨压，通过挤压产生侵入钉，侵入钉可以穿透水稻表皮，侵入到植物细胞内部，和细胞膜形成一个空腔结构[3]。侵入钉侵入植物细胞后，和水稻持续一段共生状态，随后分化成侵染菌丝，并迅速扩展到整个细胞以及临近细胞，接着叶片出现病斑。这些病斑在合适的条件下，会重新产生分生孢子梗，接着分化产生大量的分生孢子，从病斑中释放出来，这些新释放的孢子可以被潮湿的空气带到附近的水稻植株上，开始新一轮的侵染[4]。后期稻瘟病菌以菌丝体和分生孢子的形式在病稻草或谷粒上越冬，成为下一年的侵染源。
稻瘟病菌侵染水稻符合基因对基因假说。植物抗病防御信号调控途径可分为两种，依赖于植物病原物分子识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)激活的信号途径[5]和通过效应蛋白(Effectors)激活的信号途径[6]。在植物与病原物的早期进化过程中，病原物通过分泌病原物相关分子(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs) 破坏植物细胞，导致感病；另一方面，植物进化出了一类PRRs分子受体，通过识别特异性病原物分子，激发植物抗病信号以抑制病原物侵染。这种基于植物病原物分子受体——病原物分子的识别模式被称为病原物分子诱导的抗病反应(PAMPtriggered immunity,PTI)。针对植物的这种抗病反应，病原物进化出新的侵染机制以克服或者抑制植物病原物分子诱导的抗性，此类系统通过分泌效应蛋白(Effectors)直接进入植物细胞内，破坏植物体而导致感病，因此被称为效应蛋白诱导的感病性(Effector triggered susceptibility,ETS)。相应地，植物也进化出了相应的抗性基因(Resistance genes)，通过直接或间接的相互作用识别效应蛋白，并激发强烈的抗病反应，故被称为效应蛋白诱导的抗病性(Effectortriggeredimmunity，ETI) 。稻瘟病菌的效应分子主要通过两种方式进入到植物细胞中，细胞质效应分子，如 Pwl1, Pwl2, Bas2, and AvrPizT，通过活体营养界面复合体（BIC）传递到植物细胞内，BIC是有寄主的细胞质膜形成的特殊结构；另一种效应分子，质外体效应分子，如Bas4，主要积聚在侵染菌丝和寄主包膜（EIHM）之间[7]。
SNARE蛋白在细胞内的膜泡融合过程中起着重要的作用[8]。它们通过链式结构的SNARE结构域锚定在膜上。在不同的膜结构上形成的四螺旋束可以牵引这些膜进入临近的结构中启动膜的融合[9,10]。SNARE蛋白Syn8在酵母中主要参与晚期内含体到高尔基体转运过程。实验室在之前的研究中，已经从稻瘟病菌中克隆了酵母中SYN8同源基因MoSYN8，并采用基因敲除的方法对其生物学功能进行研究。而本研究主内容是，通过对比MoSYN8突变体与野生型Guy11外泌蛋白的双向电泳图（图1中的A9点），选取其中存在灰度差异的一种外泌蛋白MoPrs，对其进行基因敲除并进行生物学研究分析。
图1 MoSYN8突变体与野生型Guy11外泌蛋白的双向电泳图
1 材料与方法
1.1 PCR引物序列
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