osppkl1对互作蛋白pip3的去磷酸化分析
水稻作为最重要的粮食作物之一，其籽粒发育的研究对提高单产有重要意义。OsPPKL1突变后水稻粒长变长，过量表达后粒长变短，说明其在水稻籽粒的粒型发育中起着负调控的作用。为了明确OsPPKL1调控水稻粒型的分子机制，本研究通过酵母双杂交技术得到OsPPKL1的互作蛋白PIP3。OsPPKL1在点突变后磷酸酶的活性发生变化，对PIP3的去磷酸化程度也会有所变化。通过构建GST-PIP3蛋白表达载体，诱导纯化获得PIP3的蛋白后，研究了OsPPKL1对PIP3的去磷酸化程度。结果显示OsPPKL1可以将PIP3进行去磷酸化，为进一步研究OsPPKL1的功能奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1实验材料 3
1.1.1植物材料 3
1.1.2菌株、质粒和试剂盒3
1.2实验方法 3
1.2.1酵母感受态细胞制备及转化3
1.2.2双分子荧光互补分析4
1.2.3构建GSTPIP3载体4
1.2.4 GSTPIP3质粒转化为BL21感受态5
1.2.5诱导纯化GSTPIP3的蛋白6
2结果与分析7
2.1利用酵母双杂交技术验证OsPPKL1和PIP3的相互作用7
2.2 利用BiFC方法验证OsPPKL1与 PIP3的相互作用8
2.3构建pGEX2TPIP3载体结果8
2.4诱导纯化GSTPIP3的蛋白结果与分析9
2.5酶活性的测定结果与分析10
3讨论 10
致谢11
参考文献11
OsPPKL1对互作蛋白PIP3的去磷酸化分析
引言
引言 水稻作为主要粮食作物，提高其粮食生产总量，这对于满足人们不断增长的各种需要具有重要意义。每株穗数、每穗籽粒数和籽粒重量三者共同决定了水稻的单株产量，其中水稻的籽粒重量由其籽粒大小、灌浆程度共同决定。若灌浆程度达到理想状态，水稻籽粒重量可以直观的描述为水稻的籽粒大小。从外观
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
上看，水稻的籽粒大小又可以细分为籽粒长度、宽度和厚度，是典型的数量性状，且有较高的遗传力[1]。水稻籽粒的长宽厚直接关系到水稻的粒重，还影响着水稻的长宽比等外观品质[2]。研究者采用不同的遗传资源和群体定位了有关水稻粒重的QTL位点约315 个，定位到调控粒长的QTL 75个，调控粒宽的QTL 66个。中国国家水稻数据中心对大量的定位结果进行了数据的整合和分析，发现控制水稻粒重和粒型的位点几乎分布于水稻的所有12条染色体。
目前已经鉴定了多个控制水稻籽粒大小的基因，它们对于水稻籽粒的控制有些是通过控制颖壳的某一方向细胞的数目来调控籽粒的长短和宽窄，有些是通过调节水稻颖壳中细胞的大小来调控的。有研究表明，GS3、DEP1属于一种非典型性G 蛋白复合体的γ亚基，区别于拟南芥同源蛋白AGG3 在G 蛋白信号通路中的正向调节功能，GS3和DEP1在G蛋白信号途径中的功能是进行负向调控，推测认为GS3和DEP1是通过与RGB1竞争性的与RGG1 和RGG2 结合降低了Gβ1γ1和Gβ1γ2 的信号[3]。水稻的dwarf1 突变体缺失的基因D1 编码一个GTP绑定蛋白（GTPbindingprotein）α 亚基。异源三聚体G 蛋白是由α (Gα), β (Gβ) 和γ (Gγ) 三个不同的亚基构成的，而且在信号从细胞外传递到细胞内的过程中起到多种功用。它接受来自受体的信号将其传递给下游的感受器。在激素信号途径中扮演着分子开关的作用[4,5]。拟南芥中的研究表明：这3个不同的亚基在调控植物的发育中发挥略有差异的作用，其中的α (Gα)亚基倾向于促进细胞从G1 期到G2 的转变，正向促进轴向分裂；其中的β (Gβ)亚基，在胚轴中偏向于正向促进细胞的轴向分裂，同时抑制细胞的圆周分裂；而γ (Gγ)一般是抑制侧根的形成和器官的大小[6,7]。最近十年，对于水稻籽粒形状和籽粒重量的研究取得了较多的成果。除了GW2 是一个稀有位点之外，还有GS3、qSW5/GW5、GS5 和GW8 等位点[3,8]。因此挖掘具有应用潜力的新位点，可以为提高水稻的产量和外观品质提供新的基因资源。同时，也将有助于研究者们对水稻粒形和粒重的遗传基础的深入理解。
本实验室利用超大粒粳稻材料N411 与小粒籼稻材料N643 构建的F2 群体，进行了水稻籽粒及穗部性状的QTL定位研究[9]。检测到了控制水稻籽粒和穗部的7个性状的32个QTL 位点。其中在第2 、3、5染色体分别发现了qGW2.1，qGL3a，qGW5、qSW5/GW5、GS5。此外还发现位于第3 染色体的RM6266 与RM3350 之间存在一个同时控制粒长、粒宽、粒厚、粒重和穗长的新位点qGL3。利用新开发的InDel 标记对2968 个个体构成的大分离群体N411×9311 BC2F3 中获得的重组个体进行重组位点的高精度分析，结合后代的表型测验，最终将qGL3 定位在 InDel标记 XJ39与 XJ26之间的46.6 Kb的范围之内。在这一区间内，鉴定出唯一亲本间有差异的候选基因ORF4（LOC_Os03g44500）。ORF4 编码一个含有两个 Kelch 结构域的 PP2A 蛋白磷酸酶（OsPPKL1）。来自9311和 N411 不同等位基因的转基因研究结果表明，在中花11 中过量表达OsPPKL19311 引起水稻籽粒的变短，而过表达 OsPPKL1N411 并不会引起籽粒的明显变化，说明等位基因OsPPKL1N411 丢失了OsPPKL19311 的负调控功能，进而形成较长的籽粒。对 OsPPKL19311 的 Kelch 和 PP2A 功能域的分别过表达转基因发现，单独过表达 Kelch 9311 引起籽粒的明显变短，单独过表达的 PP2A9311 不会引起籽粒的变化，表明 OsPPKL19311 中的 Kelch 结构域是 OsPPKL19311 发挥负调控功能的关键结构域[9]。从粳稻品种Waiyin3（WY3）中也克隆了控制粒长的GL3.1基因，该基因与我们克隆的qGL3 为同一个位点，研究表明来自WY3 的GL3.1 过量表达增加了粒长，而GL3.1 可能通过去磷酸化细胞周期蛋白CyclinT1;3，从而影响了细胞分裂实现对粒长的调控[10]。然而我们的研究表明OsPPKL1 的功能缺失（osppkl1 的TDNA 插入突变体）导致了粒长的增加，而来自N411 的OsPPKL1 过量表达并没有引起转基因水稻粒长的显著变化[9]。虽然导致这些差别的原因还需要进一步的研究，但可以肯定的是OsPPKL1/GL3.1 在水稻籽粒发育过程中必然发挥了重要的调控作用。为了研究OsPPKL1 调控水稻粒长的分子机制,我们通过酵母双杂交技术，将OsPPKL1 作为钓饵质粒，按照酵母双杂共转化法，对AD 文库质粒转化BDPIP3 涂布 SD/LWHAde筛选培养基，获得若干克隆。将获得的克隆滴定在三缺+3AT的 SD 筛选培养基上，将仍能健康生长的克隆提取酵母质粒。即我们以OsPPKL1 为诱饵蛋白筛选水稻幼穗的cDNA文库，从中挑选与 OsPPKL1 相互作用的蛋白 PIP3。PIP3作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其生物学功能表现为：与Rac/Cdc42相互作用,参与细胞粘附与迁移过程中Rac/Cdc42介导的肌动蛋白的合成，与Rac和Cdc42结合，导致其构象改变，在某种程度上缓解自我抑制和激酶活性[11]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1实验材料 3
1.1.1植物材料 3
1.1.2菌株、质粒和试剂盒3
1.2实验方法 3
1.2.1酵母感受态细胞制备及转化3
1.2.2双分子荧光互补分析4
1.2.3构建GSTPIP3载体4
1.2.4 GSTPIP3质粒转化为BL21感受态5
1.2.5诱导纯化GSTPIP3的蛋白6
2结果与分析7
2.1利用酵母双杂交技术验证OsPPKL1和PIP3的相互作用7
2.2 利用BiFC方法验证OsPPKL1与 PIP3的相互作用8
2.3构建pGEX2TPIP3载体结果8
2.4诱导纯化GSTPIP3的蛋白结果与分析9
2.5酶活性的测定结果与分析10
3讨论 10
致谢11
参考文献11
OsPPKL1对互作蛋白PIP3的去磷酸化分析
引言
引言 水稻作为主要粮食作物，提高其粮食生产总量，这对于满足人们不断增长的各种需要具有重要意义。每株穗数、每穗籽粒数和籽粒重量三者共同决定了水稻的单株产量，其中水稻的籽粒重量由其籽粒大小、灌浆程度共同决定。若灌浆程度达到理想状态，水稻籽粒重量可以直观的描述为水稻的籽粒大小。从外观
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
上看，水稻的籽粒大小又可以细分为籽粒长度、宽度和厚度，是典型的数量性状，且有较高的遗传力[1]。水稻籽粒的长宽厚直接关系到水稻的粒重，还影响着水稻的长宽比等外观品质[2]。研究者采用不同的遗传资源和群体定位了有关水稻粒重的QTL位点约315 个，定位到调控粒长的QTL 75个，调控粒宽的QTL 66个。中国国家水稻数据中心对大量的定位结果进行了数据的整合和分析，发现控制水稻粒重和粒型的位点几乎分布于水稻的所有12条染色体。
目前已经鉴定了多个控制水稻籽粒大小的基因，它们对于水稻籽粒的控制有些是通过控制颖壳的某一方向细胞的数目来调控籽粒的长短和宽窄，有些是通过调节水稻颖壳中细胞的大小来调控的。有研究表明，GS3、DEP1属于一种非典型性G 蛋白复合体的γ亚基，区别于拟南芥同源蛋白AGG3 在G 蛋白信号通路中的正向调节功能，GS3和DEP1在G蛋白信号途径中的功能是进行负向调控，推测认为GS3和DEP1是通过与RGB1竞争性的与RGG1 和RGG2 结合降低了Gβ1γ1和Gβ1γ2 的信号[3]。水稻的dwarf1 突变体缺失的基因D1 编码一个GTP绑定蛋白（GTPbindingprotein）α 亚基。异源三聚体G 蛋白是由α (Gα), β (Gβ) 和γ (Gγ) 三个不同的亚基构成的，而且在信号从细胞外传递到细胞内的过程中起到多种功用。它接受来自受体的信号将其传递给下游的感受器。在激素信号途径中扮演着分子开关的作用[4,5]。拟南芥中的研究表明：这3个不同的亚基在调控植物的发育中发挥略有差异的作用，其中的α (Gα)亚基倾向于促进细胞从G1 期到G2 的转变，正向促进轴向分裂；其中的β (Gβ)亚基，在胚轴中偏向于正向促进细胞的轴向分裂，同时抑制细胞的圆周分裂；而γ (Gγ)一般是抑制侧根的形成和器官的大小[6,7]。最近十年，对于水稻籽粒形状和籽粒重量的研究取得了较多的成果。除了GW2 是一个稀有位点之外，还有GS3、qSW5/GW5、GS5 和GW8 等位点[3,8]。因此挖掘具有应用潜力的新位点，可以为提高水稻的产量和外观品质提供新的基因资源。同时，也将有助于研究者们对水稻粒形和粒重的遗传基础的深入理解。
本实验室利用超大粒粳稻材料N411 与小粒籼稻材料N643 构建的F2 群体，进行了水稻籽粒及穗部性状的QTL定位研究[9]。检测到了控制水稻籽粒和穗部的7个性状的32个QTL 位点。其中在第2 、3、5染色体分别发现了qGW2.1，qGL3a，qGW5、qSW5/GW5、GS5。此外还发现位于第3 染色体的RM6266 与RM3350 之间存在一个同时控制粒长、粒宽、粒厚、粒重和穗长的新位点qGL3。利用新开发的InDel 标记对2968 个个体构成的大分离群体N411×9311 BC2F3 中获得的重组个体进行重组位点的高精度分析，结合后代的表型测验，最终将qGL3 定位在 InDel标记 XJ39与 XJ26之间的46.6 Kb的范围之内。在这一区间内，鉴定出唯一亲本间有差异的候选基因ORF4（LOC_Os03g44500）。ORF4 编码一个含有两个 Kelch 结构域的 PP2A 蛋白磷酸酶（OsPPKL1）。来自9311和 N411 不同等位基因的转基因研究结果表明，在中花11 中过量表达OsPPKL19311 引起水稻籽粒的变短，而过表达 OsPPKL1N411 并不会引起籽粒的明显变化，说明等位基因OsPPKL1N411 丢失了OsPPKL19311 的负调控功能，进而形成较长的籽粒。对 OsPPKL19311 的 Kelch 和 PP2A 功能域的分别过表达转基因发现，单独过表达 Kelch 9311 引起籽粒的明显变短，单独过表达的 PP2A9311 不会引起籽粒的变化，表明 OsPPKL19311 中的 Kelch 结构域是 OsPPKL19311 发挥负调控功能的关键结构域[9]。从粳稻品种Waiyin3（WY3）中也克隆了控制粒长的GL3.1基因，该基因与我们克隆的qGL3 为同一个位点，研究表明来自WY3 的GL3.1 过量表达增加了粒长，而GL3.1 可能通过去磷酸化细胞周期蛋白CyclinT1;3，从而影响了细胞分裂实现对粒长的调控[10]。然而我们的研究表明OsPPKL1 的功能缺失（osppkl1 的TDNA 插入突变体）导致了粒长的增加，而来自N411 的OsPPKL1 过量表达并没有引起转基因水稻粒长的显著变化[9]。虽然导致这些差别的原因还需要进一步的研究，但可以肯定的是OsPPKL1/GL3.1 在水稻籽粒发育过程中必然发挥了重要的调控作用。为了研究OsPPKL1 调控水稻粒长的分子机制,我们通过酵母双杂交技术，将OsPPKL1 作为钓饵质粒，按照酵母双杂共转化法，对AD 文库质粒转化BDPIP3 涂布 SD/LWHAde筛选培养基，获得若干克隆。将获得的克隆滴定在三缺+3AT的 SD 筛选培养基上，将仍能健康生长的克隆提取酵母质粒。即我们以OsPPKL1 为诱饵蛋白筛选水稻幼穗的cDNA文库，从中挑选与 OsPPKL1 相互作用的蛋白 PIP3。PIP3作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其生物学功能表现为：与Rac/Cdc42相互作用,参与细胞粘附与迁移过程中Rac/Cdc42介导的肌动蛋白的合成，与Rac和Cdc42结合，导致其构象改变，在某种程度上缓解自我抑制和激酶活性[11]。
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