一个水稻粒形相关基因的初步定位
水稻是世界上重要的粮食作物之一，研究水稻的粒形遗传机理具有非常重要的意义。粒形不仅有利于提高水稻产量，还有利于提高稻米的外观品质，选择合适的粒型材料作为亲本，可为选育高产优质的水稻品种提供基础。而水稻粒形的直接影响着水稻的品质和产量，因此对于水稻粒形遗传机理的研究需要更加深入。本研究利用一个NJ35圆粒突变体，通过遗传分析结果表明该突变体的表型由隐性单基因控制。该突变体表现出籽粒变圆，籽粒长宽厚均较野生型有所下降。通过初定位，采用隐性极端个体定位法，将基因初步连锁在第五染色体N5-18和N5-23之间。这为进一步对粒形相关基因克隆与功能分析提供了良好的基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.2 方法 4
1.2.1水稻粒形异常基因表型鉴定 4
1.2.2水稻粒形异常基因定位 4
1.2.2.1植物总DNA的提取（SDS法） 4
1.2.2.1.1溶液配制 4
1.2.2.1.2 DNA提取 4
1.2.2.1.3 DNA浓度及质量检测 4
1.2.2.2基因定位 5
1.2.2.2.1遗传分析与定位群体 5
1.2.2.2.2引物分析 5
1.2.2.2.3PCR反应 5
1.2.2.2.4PCR产物检测 5
1.2.2.2.5条带读取与数据分析 6
2 结果与分析 6
2.1 NJ35/N22的遗传分析及多态性标记筛选 6
2.2 野生型NJ35与TR粒形突变体表型鉴定 6
2.3 粒形相关基因的连锁 7
3讨论 8
致谢 9
参考文献 9
一个水稻粒形相关基因的初步定位
种子科学与工程 马金平
引言
引言
水稻粒形是衡量稻米外观品质的一个重要指标。近年来，长粒优质籼米占居50%～55%的国际大米贸易量。米粒细长一
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
直是泰国、美国、菲律宾（国际水稻研究所）、巴基斯坦、澳大利亚、印度等国水稻育种的最主要目标之一。我国也将稻米长宽比作为评价籼稻米质的一个重要因素；然而，当前我国主栽籼稻品种（如协优559、汕优63、特优559、Ⅱ优129等）的粒形都未达到国家优质米标准。
水稻不仅是主要的粮食作物，也是现代分子生物学研究的模式植物。在我国有超过 8 亿的人口以稻米为主食。随着我国人口的增长、经济的发展、城市的扩张，我国的耕地面积呈刚性下降，人均耕地不断减少，如何在这种严峻的形式下完成水稻单产增长，以保障我国粮食安全，提高单产是水稻育种者永恒的目标。
水稻千粒重是其库容量和产量潜力的重要决定因素,是育种家进行新品种选育时重要的选择性状,也是水稻四个产量构成因子即结实率、每穗粒数、有效穗和千粒重中遗传力最高的一个因子。水稻籽粒作为主要食用部分，其大小和形状直接影响着水稻的产量构成和品质。通过了解水稻粒形的遗传，明确其生长发育的机理，将为培育高产、优质的水稻品种奠定基础。利用目前日益完善的分子生物学技术，分离控制粒型的基因，是了解籽粒性状遗传，掌握水稻籽粒发育机理从而实现水稻高产的有效手段。此外，水稻作为禾本科模式植物，其基因功能的研究，可为其他禾本科作物的研究提供借鉴。
目前对于控制粒形基因的定位主要集中在 QTL 方面，已成功定位并公布的相关基因有200多个,但是完成克隆和基因功能分析的只有TGW6、SG1、GS5、qSW5、GIF1、GS3、GW5以及GW2。
GS3是一个控制水稻粒长及粒重的QTL，它在控制籽粒和器官大小过程中作为负向调节因子起作用。作者通过构建NIL将GS3分离成单个的孟德尔因子并将其克隆。GS3含有5个外显子，编码一个包含232个氨基酸的蛋白，该蛋白含一个类PEBP结构域（OSR），一个跨膜区，一个TNFR/NGFR家族富含半胱氨酸结构域和一个VWFC模块（Fan, et al. 2006）。这些结构域在调节籽粒大小中发挥不同的功能，其中OSR结构域是GS3作为一个负调节子发挥作用所必须的。OSR功能的缺失会使得水稻籽粒变长。C端的TNFR/NGFR和VWFC对OSR的功能有抑制作用，它们功能的缺失则会产生非常短的籽粒。
Zhang等（2012）通过筛选种质资源库发现一个超大粒的粳稻品种N411。为了探究其大粒的遗传基础，作者利用N411与籼稻小粒品种N643进行杂交产生的F2群体进行粒型QTL分析，鉴定出一个新的位于第3染色体长臂控制粒长的QTL，命名为qGL3。为了克隆qGL3，作者利用籼稻品种9311作为回交亲本构建BC2F3群体进行精细定位，最终将qGL3限定在46.6kb的区间内。通过测序，作者发现其中一个ORF在两个亲本间存在4处单碱基的差异，转基因结果表明这个基因就是qGL3。qGL3编码一个含有两个Kelch功能域的蛋白磷酸酶OsPPKL1，同时作者发现Kelch功能域在OsPPKL1的负调节功能中是充分必要的，且位于第二个Kelch功能域上AVLDT区域的D364E的稀有等位变异qgl3导致长粒的表型。此外，作者对OsPPKL1的两个同源基因的功能进行验证，在中花11中分别过表达OsPPKL2和OsPPKL3，发现OEOsPPKL3转基因株系与OEOsPPKL1表型相似，籽粒粒长较短，然而OEOsPPKL2株系出现了更长的籽粒。TDNA插入突变体osppkl3和osppkl2与其野生型相比分别表现出长粒与短粒的表型，这些结果表明OsPPKL2正调控细胞的伸长及分裂，而OsPPKL1/3作为负调控因子行使功能。作者通过田间试验发现qgl3（N411）的应用能够显著提高常规稻和杂交稻的产量，说明qgl3在培育水稻良种过程中存在潜在的利用价值。
Song等（2007）利用大粒的粳稻品种WY3和小粒籼稻良种丰矮占1号（FAZ1）的F2群体中检测到控制粒重、粒宽、粒长、粒厚性状的7个QTLs，其中GW2是一个位于第2染色体控制籽粒宽度的主效QTL。作者利用高代回交群体将GW2定位在8.2kb区间内，在该区间仅存在一个ORF。通过测序分析发现在两亲本中该ORF存在两处单碱基的置换，但并不产生氨基酸的变化，而亲本WY3中还存在1bp的缺失导致蛋白翻译提前终止，由此可确定该ORF即为GW2。GW2 编码一个环型E3泛素连接酶，定位于细胞质中。
Wan等（2005）通过对籼稻IR24（窄粒）和粳稻Asominori（宽粒）的重组自交系群体（RIL）和以Asominori为背景亲本插入IR24染色体片段的置换系（CSSLs）检测控制水稻粒宽的QTLs，经过多年多点的验证发现了一个稳定存在的QTL位点GW5。遗传分析表明gw5（IR24）是控制水稻籽粒长宽比和籽粒宽度的隐性基因。Weng等（2008）为进一步探究GW5的调控机制，利用CSSL28（窄粒）与Asominori的分离群体将GW5精细定位到22.2kb的区间内。通过测序，作者发现Asominori与CSSL28及IR24相比在该区间缺失了1.2kb的碱基序列。CSSL28和IR24在定位区间存在三个ORF，其中ORF1和ORF3在IR24和Asominori间不存在差异，而在Asominori的缺失片段处CSSL28存在一个ORF2，初步将ORF2确定为GW5的候选基因。作者收集了12份野生稻和46份栽培品种，对这些品种的该区段进行了测序，发现窄粒品种和野生稻含有该区段，而宽粒品种中该片段缺失，因此作者认为ORF2即GW5不仅与粒型相关，而且在水稻的驯化过程中被选择。GW5定位到了细胞核内，利用酵母双杂系统筛选到多聚泛素蛋白与GW5互作，因此作者推测GW5可能是在细胞核中参与泛素化蛋白酶体途径来调控籽粒的大小。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.2 方法 4
1.2.1水稻粒形异常基因表型鉴定 4
1.2.2水稻粒形异常基因定位 4
1.2.2.1植物总DNA的提取（SDS法） 4
1.2.2.1.1溶液配制 4
1.2.2.1.2 DNA提取 4
1.2.2.1.3 DNA浓度及质量检测 4
1.2.2.2基因定位 5
1.2.2.2.1遗传分析与定位群体 5
1.2.2.2.2引物分析 5
1.2.2.2.3PCR反应 5
1.2.2.2.4PCR产物检测 5
1.2.2.2.5条带读取与数据分析 6
2 结果与分析 6
2.1 NJ35/N22的遗传分析及多态性标记筛选 6
2.2 野生型NJ35与TR粒形突变体表型鉴定 6
2.3 粒形相关基因的连锁 7
3讨论 8
致谢 9
参考文献 9
一个水稻粒形相关基因的初步定位
种子科学与工程 马金平
引言
引言
水稻粒形是衡量稻米外观品质的一个重要指标。近年来，长粒优质籼米占居50%～55%的国际大米贸易量。米粒细长一
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
直是泰国、美国、菲律宾（国际水稻研究所）、巴基斯坦、澳大利亚、印度等国水稻育种的最主要目标之一。我国也将稻米长宽比作为评价籼稻米质的一个重要因素；然而，当前我国主栽籼稻品种（如协优559、汕优63、特优559、Ⅱ优129等）的粒形都未达到国家优质米标准。
水稻不仅是主要的粮食作物，也是现代分子生物学研究的模式植物。在我国有超过 8 亿的人口以稻米为主食。随着我国人口的增长、经济的发展、城市的扩张，我国的耕地面积呈刚性下降，人均耕地不断减少，如何在这种严峻的形式下完成水稻单产增长，以保障我国粮食安全，提高单产是水稻育种者永恒的目标。
水稻千粒重是其库容量和产量潜力的重要决定因素,是育种家进行新品种选育时重要的选择性状,也是水稻四个产量构成因子即结实率、每穗粒数、有效穗和千粒重中遗传力最高的一个因子。水稻籽粒作为主要食用部分，其大小和形状直接影响着水稻的产量构成和品质。通过了解水稻粒形的遗传，明确其生长发育的机理，将为培育高产、优质的水稻品种奠定基础。利用目前日益完善的分子生物学技术，分离控制粒型的基因，是了解籽粒性状遗传，掌握水稻籽粒发育机理从而实现水稻高产的有效手段。此外，水稻作为禾本科模式植物，其基因功能的研究，可为其他禾本科作物的研究提供借鉴。
目前对于控制粒形基因的定位主要集中在 QTL 方面，已成功定位并公布的相关基因有200多个,但是完成克隆和基因功能分析的只有TGW6、SG1、GS5、qSW5、GIF1、GS3、GW5以及GW2。
GS3是一个控制水稻粒长及粒重的QTL，它在控制籽粒和器官大小过程中作为负向调节因子起作用。作者通过构建NIL将GS3分离成单个的孟德尔因子并将其克隆。GS3含有5个外显子，编码一个包含232个氨基酸的蛋白，该蛋白含一个类PEBP结构域（OSR），一个跨膜区，一个TNFR/NGFR家族富含半胱氨酸结构域和一个VWFC模块（Fan, et al. 2006）。这些结构域在调节籽粒大小中发挥不同的功能，其中OSR结构域是GS3作为一个负调节子发挥作用所必须的。OSR功能的缺失会使得水稻籽粒变长。C端的TNFR/NGFR和VWFC对OSR的功能有抑制作用，它们功能的缺失则会产生非常短的籽粒。
Zhang等（2012）通过筛选种质资源库发现一个超大粒的粳稻品种N411。为了探究其大粒的遗传基础，作者利用N411与籼稻小粒品种N643进行杂交产生的F2群体进行粒型QTL分析，鉴定出一个新的位于第3染色体长臂控制粒长的QTL，命名为qGL3。为了克隆qGL3，作者利用籼稻品种9311作为回交亲本构建BC2F3群体进行精细定位，最终将qGL3限定在46.6kb的区间内。通过测序，作者发现其中一个ORF在两个亲本间存在4处单碱基的差异，转基因结果表明这个基因就是qGL3。qGL3编码一个含有两个Kelch功能域的蛋白磷酸酶OsPPKL1，同时作者发现Kelch功能域在OsPPKL1的负调节功能中是充分必要的，且位于第二个Kelch功能域上AVLDT区域的D364E的稀有等位变异qgl3导致长粒的表型。此外，作者对OsPPKL1的两个同源基因的功能进行验证，在中花11中分别过表达OsPPKL2和OsPPKL3，发现OEOsPPKL3转基因株系与OEOsPPKL1表型相似，籽粒粒长较短，然而OEOsPPKL2株系出现了更长的籽粒。TDNA插入突变体osppkl3和osppkl2与其野生型相比分别表现出长粒与短粒的表型，这些结果表明OsPPKL2正调控细胞的伸长及分裂，而OsPPKL1/3作为负调控因子行使功能。作者通过田间试验发现qgl3（N411）的应用能够显著提高常规稻和杂交稻的产量，说明qgl3在培育水稻良种过程中存在潜在的利用价值。
Song等（2007）利用大粒的粳稻品种WY3和小粒籼稻良种丰矮占1号（FAZ1）的F2群体中检测到控制粒重、粒宽、粒长、粒厚性状的7个QTLs，其中GW2是一个位于第2染色体控制籽粒宽度的主效QTL。作者利用高代回交群体将GW2定位在8.2kb区间内，在该区间仅存在一个ORF。通过测序分析发现在两亲本中该ORF存在两处单碱基的置换，但并不产生氨基酸的变化，而亲本WY3中还存在1bp的缺失导致蛋白翻译提前终止，由此可确定该ORF即为GW2。GW2 编码一个环型E3泛素连接酶，定位于细胞质中。
Wan等（2005）通过对籼稻IR24（窄粒）和粳稻Asominori（宽粒）的重组自交系群体（RIL）和以Asominori为背景亲本插入IR24染色体片段的置换系（CSSLs）检测控制水稻粒宽的QTLs，经过多年多点的验证发现了一个稳定存在的QTL位点GW5。遗传分析表明gw5（IR24）是控制水稻籽粒长宽比和籽粒宽度的隐性基因。Weng等（2008）为进一步探究GW5的调控机制，利用CSSL28（窄粒）与Asominori的分离群体将GW5精细定位到22.2kb的区间内。通过测序，作者发现Asominori与CSSL28及IR24相比在该区间缺失了1.2kb的碱基序列。CSSL28和IR24在定位区间存在三个ORF，其中ORF1和ORF3在IR24和Asominori间不存在差异，而在Asominori的缺失片段处CSSL28存在一个ORF2，初步将ORF2确定为GW5的候选基因。作者收集了12份野生稻和46份栽培品种，对这些品种的该区段进行了测序，发现窄粒品种和野生稻含有该区段，而宽粒品种中该片段缺失，因此作者认为ORF2即GW5不仅与粒型相关，而且在水稻的驯化过程中被选择。GW5定位到了细胞核内，利用酵母双杂系统筛选到多聚泛素蛋白与GW5互作，因此作者推测GW5可能是在细胞核中参与泛素化蛋白酶体途径来调控籽粒的大小。
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