秦岭凹叶厚朴内生真菌分离及初步鉴定
摘 要通过对凹叶厚朴内生真菌的鉴定研究，进一步丰富凹叶厚朴内生真菌种群的多样性，从而推动内生真菌的研究发展，使我们能够更加合理有效的利用药用植物资源，丰富药用植物内生菌菌种资源库。通过无菌操作对凹叶厚朴内生真菌进行分离、纯化，得到纯菌株，采用插片法对其进行形态学观察。根据内生真菌的菌落形态和显微形态特征，对其分类地位进行初步鉴定完成实验。本实验通过传统形态学方法对分离得到的34株内生真菌进行初步鉴定，鉴定结果为：1纲，3目，4科，9属。其中曲霉属3株，青霉属1株，葡萄孢属2株，胶帚霉属1株，镰刀菌属16株，枝孢属5株，交链孢属1株，束丝核菌属2株，组丝核菌属3株。其中四川都江堰共分离14株，优势菌群为枝孢属；陕西汉中共分离20株，优势菌群为镰刀菌属。本实验通过对凹叶厚朴内生真菌的分离、纯化及初步鉴定，对凹叶厚朴内生真菌进行初步研究，为合理利用凹叶厚朴药用成分及保护凹叶厚朴药用植物资源提供理论依据。目 录
1 文献综述
1 .1 凹叶厚朴的研究现状 1
1.1.1 凹叶厚朴植物的简介 1
1.1.2 凹叶厚朴化学成分研究 2
1.1.3 凹叶厚朴的药理作用 3
1.2 内生真菌研究进展与分析 4
1.2.1 植物内生真菌的定义 4
1.2.2 内生真菌与植物的关系 4
1.2.3 植物内生菌产生活性代谢产物的机制 5
1.3 结语 6
2 实验部分
2.1 实验材料 7
2.1.1 植物材料 7
2.1.2 实验仪器及试剂 7
2.1.3 培养基及主要溶液配制 7
2.2 实验方法 7
2.2.1 内生真菌的分离 8
2.2.2 内生真菌的纯化 8
2.2.3 内生真菌形态学观察及菌株初步鉴定 8
2.3 结果与分析 8
2.3.1 凹叶厚朴中内生真菌的分离、纯化 8
2.3.2 结果分析 14
结论 16
参考文献 17
致谢 19
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴的研究现状
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
2.2 内生真菌的纯化 8
2.2.3 内生真菌形态学观察及菌株初步鉴定 8
2.3 结果与分析 8
2.3.1 凹叶厚朴中内生真菌的分离、纯化 8
2.3.2 结果分析 14
结论 16
参考文献 17
致谢 19
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴的研究现状
1.1.1 凹叶厚朴植物的简介
根据《中国植物志》所述，厚朴为木兰科木兰属植物，叶大叶柄粗壮，花呈白色，有芳香气味。产于陕西南部、甘肃东南部、河南东南部、湖北西部、四川中部、贵州东北部。生于海拔3001500米的山地林间。广西北部、江西庐山及浙江均有栽培。厚朴树皮、根皮、花、种子及芽皆可入药用，以树皮为主，为我国特有中药之一。凹叶厚朴为厚朴的一个亚种，两者不同之处在于凹叶厚朴的叶先端凹缺，其他形态特征均相同。厚朴与凹叶厚朴生长环境与习性均相同，所以二者总是交错生长。
凹叶厚朴为多年生禾本科植物，为木兰科木兰属植物厚朴的一个亚种[1]，是我国特产树种，主产浙江、福建、四川、湖北、湖南、江西等地，商品习称温朴，产量大[2] ，是我国传统的特有珍贵中药材。凹叶厚朴其性温，味苦、辛；具有温中化痰引滞、下气的功效；用于消炎灭菌、痰饮喘满、胸腹胀满、肠梗阻等症[3]。其主要药效成分是厚朴酚与和厚朴酚，两种化合物均具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗神经变性、抗抑郁等多种药理活性。经过相关文献的研究，得知浙江南部的龙景、景宁等地区是我国凹叶厚朴最大的传统产区，产量占全国总产量的50%左右。四川是川朴的主要产区，产量占全国总产的10%左右。陕西属于凹叶厚朴的边缘产区，主要产于安康、汉中一带。经调查陕西汉中地属秦岭地区，北依秦岭，南靠巴山，主要山脉有秦岭山系，属于亚热带内陆性季风气候，四季分明，光照充足，雨热同季，温暖湿润，雨量充沛等特点。四川都江堰市虹口乡，位于白沙河中游，属于亚热带湿润气候区，四季分明，夏无酷暑，冬无严寒。凹叶厚朴喜好温暖、湿润气候，这些地理环境条件下所生长出的凹叶厚朴品种较优良。在采收树龄上，传统认为凹叶厚朴种植16年后方可采剥进行利用，然而近年来对于厚朴及凹叶厚朴药理活性的研究深入，药材需求量的不断增加，大批凹叶厚朴未到采种年龄就被提前砍伐，由于过度滥伐森林和大量剥去树皮药用，导致凹叶厚朴的分布范围迅速缩小，成年野生植株极少见，已处于濒危状况。一些研究者以凹叶厚朴所含的总酚量作为研究指标，考察药材与树龄中厚朴总酚含量的关系[45]。《中国药典》对凹叶厚朴总酚的含量规定也由1995年版的3%[6]降到了2005年版的2%[7]。由于野生资源的破坏，促使人们开始大规模进行凹叶厚朴的人工栽培，全国先后建起了浙江景宁、湖北恩施、四川灌县等大面积的凹叶厚朴种植基地。但普遍存在选地不当、密度过大、抚育间伐、技术落后等问题，导致厚朴及凹叶厚朴存活率较低，栽培树种未到采剥树龄就被砍伐破坏，使厚朴及凹叶厚朴的质量与数量不能满足需求。
1.1.2 凹叶厚朴化学成分研究
1.1.2.1 酚类
凹叶厚朴中含有多种酚类物质，占凹叶厚朴总量的5%左右[8]，和厚朴酚与和厚朴酚为重要的活性物质，此外还含有四氢厚朴，龙厚朴酚，厚朴辣薄荷基等[9]。关于和厚朴酚，和厚朴酚化合物的分子机制研究的不断拓展和深入。基于电化学反应行为分析，分子的电子结构，几何形态和比较不同的药理活性的差异，对厚朴酚的基础，和厚朴酚化合物的生物靶分子的构效关系和讨论的作用。人们普遍认为，凹叶厚朴酚与和厚朴酚是凹叶厚朴的主要活性成分，利用效率较高和较低的毒性，具有药物分子的发展潜力[10]。
1.1.2.2 生物碱类
凹叶厚朴中的生物碱类成分主要为厚朴碱，此外还有白兰花碱、木兰花碱、木兰箭毒碱、武当木兰碱、氧化黄心树宁碱、瑞枯灵、罗默碱及阿朴啡生物碱等多种碱类化合物[11]。
1.1.2.3 挥发油类
凹叶厚朴的挥发油中含有多种成分，其中有效成分也有很多种。经GCMS鉴定出48种化合物[12]，其中含量最高的为桉叶醇，占挥发油总量的40%50%，此外还含有1甲基4异丙基酚、胡椒烯、邻异丙基酚、香橙烯、别香橙烯、乙酸龙脑酯、乙酸芳樟醇酯、石竹烯、榄香醇等。通过相关研究表明不同产地厚朴中挥发油的组分和相对含量存在差异，但他们任然在很大程度上决定了不同产地的药材在药效上的相似性[1314]。
1.1.2.4 其他
凹叶厚朴提取得到芦丁、棕榈酮、榔皮苷、花生酸、二十六烷醇、β谷甾醇、胡罗卜苷[15]，松脂素4OβD吡喃葡萄糖苷，凹叶厚朴具有非常强的抗病毒效果[16]、丁香脂素4,4双0βD葡萄糖苷。此外，凹叶厚朴中尚含有微量元素钙、钠、钾、镁、铁、锰、锌、铜及少量的皂苷、鞣质等[17]。
1.1.3 凹叶厚朴的药理作用
凹叶厚朴是一种古老的药材，其临床应用十分的广泛，主要有效成分为厚朴酚与和厚朴酚。两种化合物均具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗神经变性、抗抑郁等多种药理活性。
1.1.3.1 抗氧化作用
活性研究及紫外分光光度法测定厚朴酚与和厚朴酚的含量中发现：厚朴酚与和厚朴酚具有清除1,1二苯基2苦味耕基自由基活性，实验结果证实厚朴酚与和厚朴酚均具有抗氧化活性。还能清除过氧、超氧自由基，具有抗氧化作用[1
1 文献综述
1 .1 凹叶厚朴的研究现状 1
1.1.1 凹叶厚朴植物的简介 1
1.1.2 凹叶厚朴化学成分研究 2
1.1.3 凹叶厚朴的药理作用 3
1.2 内生真菌研究进展与分析 4
1.2.1 植物内生真菌的定义 4
1.2.2 内生真菌与植物的关系 4
1.2.3 植物内生菌产生活性代谢产物的机制 5
1.3 结语 6
2 实验部分
2.1 实验材料 7
2.1.1 植物材料 7
2.1.2 实验仪器及试剂 7
2.1.3 培养基及主要溶液配制 7
2.2 实验方法 7
2.2.1 内生真菌的分离 8
2.2.2 内生真菌的纯化 8
2.2.3 内生真菌形态学观察及菌株初步鉴定 8
2.3 结果与分析 8
2.3.1 凹叶厚朴中内生真菌的分离、纯化 8
2.3.2 结果分析 14
结论 16
参考文献 17
致谢 19
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴的研究现状
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
2.2 内生真菌的纯化 8
2.2.3 内生真菌形态学观察及菌株初步鉴定 8
2.3 结果与分析 8
2.3.1 凹叶厚朴中内生真菌的分离、纯化 8
2.3.2 结果分析 14
结论 16
参考文献 17
致谢 19
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴的研究现状
1.1.1 凹叶厚朴植物的简介
根据《中国植物志》所述，厚朴为木兰科木兰属植物，叶大叶柄粗壮，花呈白色，有芳香气味。产于陕西南部、甘肃东南部、河南东南部、湖北西部、四川中部、贵州东北部。生于海拔3001500米的山地林间。广西北部、江西庐山及浙江均有栽培。厚朴树皮、根皮、花、种子及芽皆可入药用，以树皮为主，为我国特有中药之一。凹叶厚朴为厚朴的一个亚种，两者不同之处在于凹叶厚朴的叶先端凹缺，其他形态特征均相同。厚朴与凹叶厚朴生长环境与习性均相同，所以二者总是交错生长。
凹叶厚朴为多年生禾本科植物，为木兰科木兰属植物厚朴的一个亚种[1]，是我国特产树种，主产浙江、福建、四川、湖北、湖南、江西等地，商品习称温朴，产量大[2] ，是我国传统的特有珍贵中药材。凹叶厚朴其性温，味苦、辛；具有温中化痰引滞、下气的功效；用于消炎灭菌、痰饮喘满、胸腹胀满、肠梗阻等症[3]。其主要药效成分是厚朴酚与和厚朴酚，两种化合物均具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗神经变性、抗抑郁等多种药理活性。经过相关文献的研究，得知浙江南部的龙景、景宁等地区是我国凹叶厚朴最大的传统产区，产量占全国总产量的50%左右。四川是川朴的主要产区，产量占全国总产的10%左右。陕西属于凹叶厚朴的边缘产区，主要产于安康、汉中一带。经调查陕西汉中地属秦岭地区，北依秦岭，南靠巴山，主要山脉有秦岭山系，属于亚热带内陆性季风气候，四季分明，光照充足，雨热同季，温暖湿润，雨量充沛等特点。四川都江堰市虹口乡，位于白沙河中游，属于亚热带湿润气候区，四季分明，夏无酷暑，冬无严寒。凹叶厚朴喜好温暖、湿润气候，这些地理环境条件下所生长出的凹叶厚朴品种较优良。在采收树龄上，传统认为凹叶厚朴种植16年后方可采剥进行利用，然而近年来对于厚朴及凹叶厚朴药理活性的研究深入，药材需求量的不断增加，大批凹叶厚朴未到采种年龄就被提前砍伐，由于过度滥伐森林和大量剥去树皮药用，导致凹叶厚朴的分布范围迅速缩小，成年野生植株极少见，已处于濒危状况。一些研究者以凹叶厚朴所含的总酚量作为研究指标，考察药材与树龄中厚朴总酚含量的关系[45]。《中国药典》对凹叶厚朴总酚的含量规定也由1995年版的3%[6]降到了2005年版的2%[7]。由于野生资源的破坏，促使人们开始大规模进行凹叶厚朴的人工栽培，全国先后建起了浙江景宁、湖北恩施、四川灌县等大面积的凹叶厚朴种植基地。但普遍存在选地不当、密度过大、抚育间伐、技术落后等问题，导致厚朴及凹叶厚朴存活率较低，栽培树种未到采剥树龄就被砍伐破坏，使厚朴及凹叶厚朴的质量与数量不能满足需求。
1.1.2 凹叶厚朴化学成分研究
1.1.2.1 酚类
凹叶厚朴中含有多种酚类物质，占凹叶厚朴总量的5%左右[8]，和厚朴酚与和厚朴酚为重要的活性物质，此外还含有四氢厚朴，龙厚朴酚，厚朴辣薄荷基等[9]。关于和厚朴酚，和厚朴酚化合物的分子机制研究的不断拓展和深入。基于电化学反应行为分析，分子的电子结构，几何形态和比较不同的药理活性的差异，对厚朴酚的基础，和厚朴酚化合物的生物靶分子的构效关系和讨论的作用。人们普遍认为，凹叶厚朴酚与和厚朴酚是凹叶厚朴的主要活性成分，利用效率较高和较低的毒性，具有药物分子的发展潜力[10]。
1.1.2.2 生物碱类
凹叶厚朴中的生物碱类成分主要为厚朴碱，此外还有白兰花碱、木兰花碱、木兰箭毒碱、武当木兰碱、氧化黄心树宁碱、瑞枯灵、罗默碱及阿朴啡生物碱等多种碱类化合物[11]。
1.1.2.3 挥发油类
凹叶厚朴的挥发油中含有多种成分，其中有效成分也有很多种。经GCMS鉴定出48种化合物[12]，其中含量最高的为桉叶醇，占挥发油总量的40%50%，此外还含有1甲基4异丙基酚、胡椒烯、邻异丙基酚、香橙烯、别香橙烯、乙酸龙脑酯、乙酸芳樟醇酯、石竹烯、榄香醇等。通过相关研究表明不同产地厚朴中挥发油的组分和相对含量存在差异，但他们任然在很大程度上决定了不同产地的药材在药效上的相似性[1314]。
1.1.2.4 其他
凹叶厚朴提取得到芦丁、棕榈酮、榔皮苷、花生酸、二十六烷醇、β谷甾醇、胡罗卜苷[15]，松脂素4OβD吡喃葡萄糖苷，凹叶厚朴具有非常强的抗病毒效果[16]、丁香脂素4,4双0βD葡萄糖苷。此外，凹叶厚朴中尚含有微量元素钙、钠、钾、镁、铁、锰、锌、铜及少量的皂苷、鞣质等[17]。
1.1.3 凹叶厚朴的药理作用
凹叶厚朴是一种古老的药材，其临床应用十分的广泛，主要有效成分为厚朴酚与和厚朴酚。两种化合物均具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗神经变性、抗抑郁等多种药理活性。
1.1.3.1 抗氧化作用
活性研究及紫外分光光度法测定厚朴酚与和厚朴酚的含量中发现：厚朴酚与和厚朴酚具有清除1,1二苯基2苦味耕基自由基活性，实验结果证实厚朴酚与和厚朴酚均具有抗氧化活性。还能清除过氧、超氧自由基，具有抗氧化作用[1
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