粘细菌发酵产胞外多糖及化学成分的初步测定
目录
1 引言 1
1.1 课题来源及立题意义 1
1.2 细菌胞外多糖的定义及其分类 1
1.3 细菌胞外多糖的制备 2
1.4 胞外多糖的生理作用 2
2材料与仪器 4
2.1菌种 4
2.2主要试剂 4
2.3主要仪器 5
2.4初始培养基 6
3 实验方法 6
3.1 菌种的活化 6
3.2 产多糖菌株的种子液培养 6
3.3 种子液的发酵培养 6
3.4 粗胞外多糖的提取 8
3.5胞外多糖的纯化 9
3.6 多糖的纯度测定 10
3.7纯化后多糖的分子量测定 10
3.8 胞外多糖的含量测定 10
4 胞外多糖组分分析 11
4.1 胞外多糖的红外图谱分析 11
4.2胞外多糖的气质图谱分析 13
4.3 糖组分薄层层析分析 13
5 实验结果与讨论 14
5.1基础发酵培养基的优化结果 14
5.2粘细菌液体发酵培养条件的优化结果 19
5.3 粘细菌胞外多糖提取条件的确定 22
5.4 经纯化后多糖含量的分析 22
5.5 粘细菌胞外多糖的纯度测定结果 23
5.6 纯化后多糖的分子量测定结果 24
5.7 多糖的含量测定结果 25
5.8 多糖的组分分析结果 25
结 论 33
致 谢 34
参考文献 35
1 引言
1.1 课题来源及立题意 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
义
本课题所研究的菌株是来源于生化院微生物实验室已分离纯化好的粘细菌MC-07。
微生物多糖是一种天然的产物，在食品、医药、饲料、石油及建筑等行业都有很好的应用价值[1]，因微生物的发酵生产周期较短、生产可控、不受季节的变化影响，且微生物胞外多糖的提取纯化工艺具有相对简单的特点等，备受科研工作者关注。21世纪是糖的世纪，1993年首届“糖生物工程”会议在美国召开，Hart提出糖生物学的时代正在加快来到[2]；在一些重要的科学杂志上可以看到糖生物学迅猛的发展，日本和英国处于领军地位，1989年糖生物工程基础和应用研究的详尽战略方案就被日本提出了，随后“糖生物工程前沿计划”也被实施了。目前，英国的牛津大学拥有最先进的测定糖链结构的设备，成功的研制了N-糖链结构分析仪并将其商品化[2]。多糖研究在我国的起步相对较晚，但也投入了大量的资金来推动多糖产业的发展，尤其是在微生物胞外多糖的研究和开发上。
从自然界筛选出具有潜在工业应用化的产胞外多糖菌株是一项很有趣且意义深远的工作，为了获得更多理化性质独特、结构特异、功能广泛的多糖；不同的微生物多糖生产菌株的是具有不同的习性的，所以需要确定适宜的培养条件来保证菌株较好的生长，并通过优化发酵培养条件获得最高多糖产量和最优多糖品质；获得的微生物多糖经过提取与纯化后，研究多糖的结构和功能。目前研究者们已经获得了较多的微生物多糖，但是能够应用于工业生产的并不多，这就需要从大自然中分离筛选出更多具有潜在工业应用化的微生物多糖生产菌[3]。本课题结合了细菌活化流程、发酵优化技术、多糖的分离纯化工艺和多糖的单糖组分分析技术。
1.2 细菌胞外多糖的定义及其分类
细菌胞外多糖(Exopolysaccharides,EPSs)，是指细菌在生长代谢过程中分泌
到细胞外的一类多糖物质，包括革兰氏阴性菌细胞膜外的多糖成分与革兰氏阳性菌的肽聚糖[4]。细菌胞外多糖有两种分类方式，根据细菌胞外多糖的分类方式有两种。按照胞外多糖在基质中的存在形式可分为两类：分别是粘液多糖(slime polysaccharide)和荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)：多糖通过分子间的氢键及其它非共价键的形式与细胞壁间形成坚韧的外膜并粘附在细胞的表面，通常称为荚膜多糖：分泌到培养基中的结构松散的粘液物质称为粘液多糖[5-6]。另一种分类方法是按照多糖的单糖组成分类：当多糖只含有一种单糖时称为同质多糖(homopolysaccharides)，如右旋糖酐、甘露聚糖、茁霉多糖、果聚糖、纤维素等；含有两种及其以上不同的单糖组分称为异质多糖(heteropolysaeeharides)，如透明质酸、结冷胶、鼠李胶、黄原胶等[7-11]。细菌产生的异质多糖中，单糖的单位通常以固定的形式有规律的重复排列，即重复单元。同质多糖和异质多糖可以是线型的，也可以是带支链结构的。异质多糖还可以分为中性多糖、含有糖醛酸或是丙酮酸残基的酸性多糖和硫酸基多糖、氨基多糖。
1.3 细菌胞外多糖的制备
当细菌胞外多糖处于较合适状态时，其纯化与制备是比较简便的，尤其是处于松散状态的粘液。在优化多糖制备的条件时，应该使其有利于最大限度的增加多糖浓度，最低限度地降解多糖。在实际操作过程中，还要注意以下几个问题：
（1）在保证菌株正常生长的前提下，尽量使用最简单又经济的培养基。
（2）优化条件要使得单个细菌的多糖产量达到最大化，而细胞的自溶裂解要达到最低。采用低温、短期培养和近中性的pH；要尽量避免胞外多糖产物被胞内的产物污染等；选择合适条件以尽量减少多糖的降解。
（3）收集、离心、洗涤生长成熟的细胞。要使荚膜、胞内多糖、微荚膜多糖离心到沉淀物中与上清液中的胞外多糖分离，只需要通过一些简单快速的步骤即可完成。细胞荚膜多糖被清除的方法各异，少数情况下，荚膜多糖是通过菌体在水、盐或缓冲液中振荡较易被去除的，而在多数情况下，还需要更加强烈的方法（中性pH下煮沸、低浓度的NaOH溶液或是高压蒸汽灭菌等）。为了加速荚膜多糖的溶解，通常采用三氯乙酸等[12]方法进行降解处理。但是在抽提后，为了进行纯度、同质性测定与结构分析，多糖需要进一步纯化，纯化过程应该避免极端的温度和pH 。
1.4 胞外多糖的生理作用
就微生物胞外多糖的生理作用而言，其本身就有多种且效果又显著，主要表现在以下几个方面：
1) 保护作用。微生物胞外多糖是真菌或细菌在遇到恶劣的生存环境时所分泌出的可以提高自己生存能力的产物，所以具有特定的生理作用与生物学活性。细菌粘液多糖和荚膜多糖的主要作用[13]：可通过螯合作用促进细胞吸收所需的金属离子、保持细胞内外部环境之间的水分平衡与防止细胞因失水过多而死亡，来抵抗有害的物质进入细胞。当外界环境不利于细菌生长的情况出现时，菌体就会分泌胞外多糖来保水保湿，以抑制其对细胞的损害作用[14]，来提高细菌对不利条件的抵抗能力。入侵细菌的噬菌体等外源病原物出现时，细菌就会主动分泌胞外多糖，一层粘稠的“强力保护罩”就会包裹在外膜表面上，从而避免噬菌体等的吞噬或溶解，充分发挥了胞外多糖的保护作[15]。
2) 识别作用。研究表明噬菌体能识别并侵害具有特殊结构荚膜的细菌，步骤如下：
①通过识别荚膜上专一的多糖分子，噬菌体从而吸附到菌体的表面；
4.2胞外多糖的气质图谱分析
4.2.1 多糖的水解
1 引言 1
1.1 课题来源及立题意义 1
1.2 细菌胞外多糖的定义及其分类 1
1.3 细菌胞外多糖的制备 2
1.4 胞外多糖的生理作用 2
2材料与仪器 4
2.1菌种 4
2.2主要试剂 4
2.3主要仪器 5
2.4初始培养基 6
3 实验方法 6
3.1 菌种的活化 6
3.2 产多糖菌株的种子液培养 6
3.3 种子液的发酵培养 6
3.4 粗胞外多糖的提取 8
3.5胞外多糖的纯化 9
3.6 多糖的纯度测定 10
3.7纯化后多糖的分子量测定 10
3.8 胞外多糖的含量测定 10
4 胞外多糖组分分析 11
4.1 胞外多糖的红外图谱分析 11
4.2胞外多糖的气质图谱分析 13
4.3 糖组分薄层层析分析 13
5 实验结果与讨论 14
5.1基础发酵培养基的优化结果 14
5.2粘细菌液体发酵培养条件的优化结果 19
5.3 粘细菌胞外多糖提取条件的确定 22
5.4 经纯化后多糖含量的分析 22
5.5 粘细菌胞外多糖的纯度测定结果 23
5.6 纯化后多糖的分子量测定结果 24
5.7 多糖的含量测定结果 25
5.8 多糖的组分分析结果 25
结 论 33
致 谢 34
参考文献 35
1 引言
1.1 课题来源及立题意 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
义
本课题所研究的菌株是来源于生化院微生物实验室已分离纯化好的粘细菌MC-07。
微生物多糖是一种天然的产物，在食品、医药、饲料、石油及建筑等行业都有很好的应用价值[1]，因微生物的发酵生产周期较短、生产可控、不受季节的变化影响，且微生物胞外多糖的提取纯化工艺具有相对简单的特点等，备受科研工作者关注。21世纪是糖的世纪，1993年首届“糖生物工程”会议在美国召开，Hart提出糖生物学的时代正在加快来到[2]；在一些重要的科学杂志上可以看到糖生物学迅猛的发展，日本和英国处于领军地位，1989年糖生物工程基础和应用研究的详尽战略方案就被日本提出了，随后“糖生物工程前沿计划”也被实施了。目前，英国的牛津大学拥有最先进的测定糖链结构的设备，成功的研制了N-糖链结构分析仪并将其商品化[2]。多糖研究在我国的起步相对较晚，但也投入了大量的资金来推动多糖产业的发展，尤其是在微生物胞外多糖的研究和开发上。
从自然界筛选出具有潜在工业应用化的产胞外多糖菌株是一项很有趣且意义深远的工作，为了获得更多理化性质独特、结构特异、功能广泛的多糖；不同的微生物多糖生产菌株的是具有不同的习性的，所以需要确定适宜的培养条件来保证菌株较好的生长，并通过优化发酵培养条件获得最高多糖产量和最优多糖品质；获得的微生物多糖经过提取与纯化后，研究多糖的结构和功能。目前研究者们已经获得了较多的微生物多糖，但是能够应用于工业生产的并不多，这就需要从大自然中分离筛选出更多具有潜在工业应用化的微生物多糖生产菌[3]。本课题结合了细菌活化流程、发酵优化技术、多糖的分离纯化工艺和多糖的单糖组分分析技术。
1.2 细菌胞外多糖的定义及其分类
细菌胞外多糖(Exopolysaccharides,EPSs)，是指细菌在生长代谢过程中分泌
到细胞外的一类多糖物质，包括革兰氏阴性菌细胞膜外的多糖成分与革兰氏阳性菌的肽聚糖[4]。细菌胞外多糖有两种分类方式，根据细菌胞外多糖的分类方式有两种。按照胞外多糖在基质中的存在形式可分为两类：分别是粘液多糖(slime polysaccharide)和荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)：多糖通过分子间的氢键及其它非共价键的形式与细胞壁间形成坚韧的外膜并粘附在细胞的表面，通常称为荚膜多糖：分泌到培养基中的结构松散的粘液物质称为粘液多糖[5-6]。另一种分类方法是按照多糖的单糖组成分类：当多糖只含有一种单糖时称为同质多糖(homopolysaccharides)，如右旋糖酐、甘露聚糖、茁霉多糖、果聚糖、纤维素等；含有两种及其以上不同的单糖组分称为异质多糖(heteropolysaeeharides)，如透明质酸、结冷胶、鼠李胶、黄原胶等[7-11]。细菌产生的异质多糖中，单糖的单位通常以固定的形式有规律的重复排列，即重复单元。同质多糖和异质多糖可以是线型的，也可以是带支链结构的。异质多糖还可以分为中性多糖、含有糖醛酸或是丙酮酸残基的酸性多糖和硫酸基多糖、氨基多糖。
1.3 细菌胞外多糖的制备
当细菌胞外多糖处于较合适状态时，其纯化与制备是比较简便的，尤其是处于松散状态的粘液。在优化多糖制备的条件时，应该使其有利于最大限度的增加多糖浓度，最低限度地降解多糖。在实际操作过程中，还要注意以下几个问题：
（1）在保证菌株正常生长的前提下，尽量使用最简单又经济的培养基。
（2）优化条件要使得单个细菌的多糖产量达到最大化，而细胞的自溶裂解要达到最低。采用低温、短期培养和近中性的pH；要尽量避免胞外多糖产物被胞内的产物污染等；选择合适条件以尽量减少多糖的降解。
（3）收集、离心、洗涤生长成熟的细胞。要使荚膜、胞内多糖、微荚膜多糖离心到沉淀物中与上清液中的胞外多糖分离，只需要通过一些简单快速的步骤即可完成。细胞荚膜多糖被清除的方法各异，少数情况下，荚膜多糖是通过菌体在水、盐或缓冲液中振荡较易被去除的，而在多数情况下，还需要更加强烈的方法（中性pH下煮沸、低浓度的NaOH溶液或是高压蒸汽灭菌等）。为了加速荚膜多糖的溶解，通常采用三氯乙酸等[12]方法进行降解处理。但是在抽提后，为了进行纯度、同质性测定与结构分析，多糖需要进一步纯化，纯化过程应该避免极端的温度和pH 。
1.4 胞外多糖的生理作用
就微生物胞外多糖的生理作用而言，其本身就有多种且效果又显著，主要表现在以下几个方面：
1) 保护作用。微生物胞外多糖是真菌或细菌在遇到恶劣的生存环境时所分泌出的可以提高自己生存能力的产物，所以具有特定的生理作用与生物学活性。细菌粘液多糖和荚膜多糖的主要作用[13]：可通过螯合作用促进细胞吸收所需的金属离子、保持细胞内外部环境之间的水分平衡与防止细胞因失水过多而死亡，来抵抗有害的物质进入细胞。当外界环境不利于细菌生长的情况出现时，菌体就会分泌胞外多糖来保水保湿，以抑制其对细胞的损害作用[14]，来提高细菌对不利条件的抵抗能力。入侵细菌的噬菌体等外源病原物出现时，细菌就会主动分泌胞外多糖，一层粘稠的“强力保护罩”就会包裹在外膜表面上，从而避免噬菌体等的吞噬或溶解，充分发挥了胞外多糖的保护作[15]。
2) 识别作用。研究表明噬菌体能识别并侵害具有特殊结构荚膜的细菌，步骤如下：
①通过识别荚膜上专一的多糖分子，噬菌体从而吸附到菌体的表面；
4.2胞外多糖的气质图谱分析
4.2.1 多糖的水解
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