艾叶不同提取部位的制备及其对致腐菌的抑制作用比较
目 录
1 引言 1
1.1 中草药的提取方法 1
1.2 抑菌方法 1
1.3 研究内容 2
1.4 研究意义 2
2 实验方法 2
2.1 实验材料 2
3 不同部位艾叶的提取工艺 3
3.1 以水为溶剂的艾叶抑菌物提取工艺 3
3.2 以95%乙醇为溶剂的艾叶抑菌物提取工艺 3
3.3 以正丁醇为溶剂的艾叶抑菌物提取工艺 4
3.4 以氯仿为溶剂的艾叶抑菌物提取工艺 4
3.5 以石油醚为溶剂的艾叶抑菌物提取工艺 4
4 不同部位艾叶提取工艺条件的优化 4
4.1 水提取部位的工艺优化 5
4.2 95%乙醇提取部位的工艺优化 6
4.3 正丁醇提取部位的工艺优化 7
4.4 氯仿提取部位的工艺优化 8
4.5 石油醚提取部位的工艺优化 9
5 抑菌 10
5.1 培养基的制备 10
5.2 菌种的活化 10
5.3 菌液的制备 10
5.4 不同浓度供试提取液的制备 10
5.5 抑菌直径的测定 10
6 结果与分析 11
6.1 不同部位提取工艺条件的优化及验证试验的结果与分析 11
6.2 抑菌实验结果与分析 27
结论 31
致谢 32
参考文献 33
1 引言
艾叶是我国的传统中药，来源于菊科植物艾Artemisia argyi Levl et V *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
ant的干燥叶。艾叶苦、辛，温，归肝脾肾经，具有温经止血[1]、散寒止痛、调经安胎的作用，为“止血要药”，是中医妇科常用药之一。临床主要用于经寒不调，少腹冷痛，寒凝经脉，安胎，杀虫止痒等，用于虚寒出血，尤宜于崩漏。艾叶药用历史悠久，始载于《名医别录》，虽然在民间应用已有几千年的历史，但对其药效成分进行科学分析和利用，则始于近代。艾叶具有药源丰富、价格低廉、不良反应小、安全性好等特点而被广泛使用。近几十年来[2]，人们对艾叶化学成分的研究更是全面深入，研究发现，艾叶的化学成分主要有挥发油[3-4]，其次还有黄酮类[5]、鞣质类[6]、三萜类[7]、桉叶烷类、多糖类[8,9]及微量元素等。现代药理研究表明，艾叶具有抗菌、抗病毒[10]、平喘镇咳祛痰、止血与抗凝血[11]、抗过敏、镇静、免疫、护肝利胆[12]及补体激活[13,14]等药理作用。
1.1 中草药的提取方法
对于中草药提取而言，溶剂提取法[15]是应用最广泛的方法，它是根据中草药中各种有效成分溶解度的性质，选用对需要成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，将所需要的活性成分从药材组织内溶解出来的一种提取方法。常见的提取溶剂可分为水、亲水性有机溶剂及亲脂性有机溶剂[16]。水：水是一种强的极性溶剂 ，可以用以提取天然药物中的亲水性成分[17]；亲水性的有机溶剂：如乙醇 （酒精）、甲醇 （木精）、丙酮等，以乙醇最常用，因为乙醇[18]的溶解性能比较好，对中草药细胞的穿透能力较强[19]。亲脂性的有机溶剂：如石油醚 、苯 、氯仿 、乙醚 、乙酸乙酯 、二氯乙烷 等。这些溶剂的选择性能强，不能或不容易提出亲水性杂质。
1.2 抑菌方法
1.2.1 牛津杯法
在灭菌培养皿中注入已经熔化冷却的营养培养基20 mL，待凝固后，加入菌液，涂布均匀，将灭菌牛津杯用无菌镊子夹出，先置于酒精灯火焰上迅速过一下火，再垂直放置于培养基表面[20,21]，轻轻按压，使杯底与培养基之间无缝隙[22]。用微量加样器分别吸取提取液200 μL注入每个牛津杯，中间的用等量生理盐水作对照。
1.2.2 滤纸片法
在超净工作台上[23,24]，将灭菌滤纸片用无菌镊子放入到含药液的灭菌培养皿中浸泡。用无菌镊子以无菌操作夹取含药纸片，将多余药液在内培养皿边上擦掉，贴在含菌平板培养基表面，轻轻按压，使药片与培养基密切接触。用泡过灭菌生理盐水滤纸片做对照。
1.3 研究内容
本实验将采用溶剂提取法，利用不同极性的溶剂对艾叶不同有效部位进行提取，以艾叶提取率为考察指标，运用单因素与正交试验考察不同料液比、提取次数、提取时间对艾叶不同极性溶剂提取率的影响，确定最佳提取工艺。在此基础上，将采用牛津杯法对不同极性溶剂提取物进行有效抑菌实验，通过比较抑菌圈的大小，寻找最佳的提取工艺，为开发艾叶抑菌保鲜剂提供可行性报告。
1.4 研究意义
在我国，由于缺乏必要的冷贮设备，果蔬采后病害的防治主要采用杀菌剂，尤其是化学杀菌剂。用化学杀菌剂会对人体健康及环境造成危害，同时使水果致腐菌产生抗药性，进一步加剧果蔬腐烂，因此迫切需要寻找一种有效而对人类无害的杀菌剂取代传统的化学杀菌剂。近年来采用中药源绿色杀菌剂替代化学杀菌剂成为了果蔬防腐行业发展的必然趋势，筛选抗菌中药并将其开发为防腐剂既然是中药二次开发的策略之一，又是果蔬防腐行业的热点。为此，本项目拟探讨艾叶对致腐菌的抑制作用研究，并寻找最佳提取部位，为开发艾叶抑菌保鲜剂提供参考。
2 实验方法
2.1 实验材料
2.1.1 药材的购买及处理
艾叶购买于安徽省万生中药饮片有限公司，批号为：141101，经熊清平老师鉴定为菊科植物艾干燥叶。粉碎机粉碎成艾绒，以备实验用。
2.1.2 菌种
霉菌：已培养好的赤霉菌，由学校实验室提供。
2.1.3 培养基
土豆培养基：去皮土豆块：蔗糖：琼脂 = 10:1:1。
2.1.4 试剂
实验试剂，见表1。
表1 实验试剂
药品 化学式 规格 厂家
旋转蒸发器 SENCO 余姚新波仪表公司
高压蒸汽灭菌锅 YM100 上海三申医疗器械有限公司
恒温培养箱 DNP-9052 上海精宏实验设备有限公司
电热恒温干燥箱 DHG-9246A 上海精宏实验设备有限公司
1 引言 1
1.1 中草药的提取方法 1
1.2 抑菌方法 1
1.3 研究内容 2
1.4 研究意义 2
2 实验方法 2
2.1 实验材料 2
3 不同部位艾叶的提取工艺 3
3.1 以水为溶剂的艾叶抑菌物提取工艺 3
3.2 以95%乙醇为溶剂的艾叶抑菌物提取工艺 3
3.3 以正丁醇为溶剂的艾叶抑菌物提取工艺 4
3.4 以氯仿为溶剂的艾叶抑菌物提取工艺 4
3.5 以石油醚为溶剂的艾叶抑菌物提取工艺 4
4 不同部位艾叶提取工艺条件的优化 4
4.1 水提取部位的工艺优化 5
4.2 95%乙醇提取部位的工艺优化 6
4.3 正丁醇提取部位的工艺优化 7
4.4 氯仿提取部位的工艺优化 8
4.5 石油醚提取部位的工艺优化 9
5 抑菌 10
5.1 培养基的制备 10
5.2 菌种的活化 10
5.3 菌液的制备 10
5.4 不同浓度供试提取液的制备 10
5.5 抑菌直径的测定 10
6 结果与分析 11
6.1 不同部位提取工艺条件的优化及验证试验的结果与分析 11
6.2 抑菌实验结果与分析 27
结论 31
致谢 32
参考文献 33
1 引言
艾叶是我国的传统中药，来源于菊科植物艾Artemisia argyi Levl et V *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
ant的干燥叶。艾叶苦、辛，温，归肝脾肾经，具有温经止血[1]、散寒止痛、调经安胎的作用，为“止血要药”，是中医妇科常用药之一。临床主要用于经寒不调，少腹冷痛，寒凝经脉，安胎，杀虫止痒等，用于虚寒出血，尤宜于崩漏。艾叶药用历史悠久，始载于《名医别录》，虽然在民间应用已有几千年的历史，但对其药效成分进行科学分析和利用，则始于近代。艾叶具有药源丰富、价格低廉、不良反应小、安全性好等特点而被广泛使用。近几十年来[2]，人们对艾叶化学成分的研究更是全面深入，研究发现，艾叶的化学成分主要有挥发油[3-4]，其次还有黄酮类[5]、鞣质类[6]、三萜类[7]、桉叶烷类、多糖类[8,9]及微量元素等。现代药理研究表明，艾叶具有抗菌、抗病毒[10]、平喘镇咳祛痰、止血与抗凝血[11]、抗过敏、镇静、免疫、护肝利胆[12]及补体激活[13,14]等药理作用。
1.1 中草药的提取方法
对于中草药提取而言，溶剂提取法[15]是应用最广泛的方法，它是根据中草药中各种有效成分溶解度的性质，选用对需要成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，将所需要的活性成分从药材组织内溶解出来的一种提取方法。常见的提取溶剂可分为水、亲水性有机溶剂及亲脂性有机溶剂[16]。水：水
1.2 抑菌方法
1.2.1 牛津杯法
在灭菌培养皿中注入已经熔化冷却的营养培养基20 mL，待凝固后，加入菌液，涂布均匀，将灭菌牛津杯用无菌镊子夹出，先置于酒精灯火焰上迅速过一下火，再垂直放置于培养基表面[20,21]，轻轻按压，使杯底与培养基之间无缝隙[22]。用微量加样器分别吸取提取液200 μL注入每个牛津杯，中间的用等量生理盐水作对照。
1.2.2 滤纸片法
在超净工作台上[23,24]，将灭菌滤纸片用无菌镊子放入到含药液的灭菌培养皿中浸泡。用无菌镊子以无菌操作夹取含药纸片，将多余药液在内培养皿边上擦掉，贴在含菌平板培养基表面，轻轻按压，使药片与培养基密切接触。用泡过灭菌生理盐水滤纸片做对照。
1.3 研究内容
本实验将采用溶剂提取法，利用不同极性的溶剂对艾叶不同有效部位进行提取，以艾叶提取率为考察指标，运用单因素与正交试验考察不同料液比、提取次数、提取时间对艾叶不同极性溶剂提取率的影响，确定最佳提取工艺。在此基础上，将采用牛津杯法对不同极性溶剂提取物进行有效抑菌实验，通过比较抑菌圈的大小，寻找最佳的提取工艺，为开发艾叶抑菌保鲜剂提供可行性报告。
1.4 研究意义
在我国，由于缺乏必要的冷贮设备，果蔬采后病害的防治主要采用杀菌剂，尤其是化学杀菌剂。用化学杀菌剂会对人体健康及环境造成危害，同时使水果致腐菌产生抗药性，进一步加剧果蔬腐烂，因此迫切需要寻找一种有效而对人类无害的杀菌剂取代传统的化学杀菌剂。近年来采用中药源绿色杀菌剂替代化学杀菌剂成为了果蔬防腐行业发展的必然趋势，筛选抗菌中药并将其开发为防腐剂既然是中药二次开发的策略之一，又是果蔬防腐行业的热点。为此，本项目拟探讨艾叶对致腐菌的抑制作用研究，并寻找最佳提取部位，为开发艾叶抑菌保鲜剂提供参考。
2 实验方法
2.1 实验材料
2.1.1 药材的购买及处理
艾叶购买于安徽省万生中药饮片有限公司，批号为：141101，经熊清平老师鉴定为菊科植物艾干燥叶。粉碎机粉碎成艾绒，以备实验用。
2.1.2 菌种
霉菌：已培养好的赤霉菌，由学校实验室提供。
2.1.3 培养基
土豆培养基：去皮土豆块：蔗糖：琼脂 = 10:1:1。
2.1.4 试剂
实验试剂，见表1。
表1 实验试剂
药品 化学式 规格 厂家
旋转蒸发器 SENCO 余姚新波仪表公司
高压蒸汽灭菌锅 YM100 上海三申医疗器械有限公司
恒温培养箱 DNP-9052 上海精宏实验设备有限公司
电热恒温干燥箱 DHG-9246A 上海精宏实验设备有限公司
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