金属螯合树脂对蛋白质的分离性能研究及条件优化(附件)
目的研究金属螯合树脂对牛血清蛋白的吸附性能，为蛋白质的分离纯化提供理论依据。方法以蛋白质的吸附率为指标，采用实验室自制金属螯合树脂对牛血清蛋白进行吸附，考察树脂量、温度、时间、pH值以及动态吸附时对蛋白质吸附率的影响，通过单因素试验和吸附动力学确定最佳吸附参数；最后通过在树脂在粗多糖中的应用，验证树脂对蛋白质的分离纯化效果。结果金属螯合树脂分离纯化蛋白质的最佳工艺参数为当牛血清蛋白质浓度为0.05 mg／mL时，最佳树脂量为0.05 g、吸附时间20 min、吸附温度25℃，金属螯合树脂的吸附率为93.83%；树脂在植物多糖中的蛋白质的脱除率为54.38%，植物多糖的保留率为98.59%；树脂在动物粗多糖中的蛋白质脱除率为89.35%。动物多糖的保留率为95.16%。结论金属螯合树脂能够较好的吸附蛏子粗多糖中蛋白质，并且对多糖的保留率高。关键词 金属螯合树脂，蛋白质，吸附
目录
1 引言 1
1.1 蛋白质分子大小差异的分离技术 1
1.2蛋白质溶解度的分离技术 2
1.3 蛋白质电荷不同的分离技术 3
1.4 蛋白质在固定金属离子亲和色谱中分离 4
2 课题研究目的及内容 5
2.1课题研究的目的 5
2.2课题研究的内容 5
2.3工艺流程图 6
3实验方法 6
3.1实验材料和设备 6
3.2金属螯合树脂吸附牛血清蛋白的工艺优化 7
3.3咪唑解析溶液的考察 8
3.4 金属螯合树脂在粗多糖中的应用 9
4结果与分析 10
4.1金属螯合树脂吸附牛血清蛋白的实验结果分析 10
4.2咪唑解析溶液的分析 12
4.3金属螯合树脂在粗多糖中的结果分析 14
结论 17
致谢 18
参考文献 19
引言
蛋白质是一类复杂有机大分子总称，作为生物体含量丰富、功能复杂、种类繁多的生物大分子，是生命活动的物质基础，在人体内发挥特异的生物学作用[1,2]。因此，蛋白质是解开人类对于生物体研究的一枚关键钥匙。
自从蛋白质被 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
发现以来，人们一直对蛋白质进行研究，而在蛋白质的研究和应用的过程中，往往需要提取出比较纯的蛋白质有机物，这就涉及了蛋白质的分离处理。
但是根据现有的技术来说，分离纯化并不容易，并且难度也比较大，成本也高。因此这方面的研究亟需改良和创新。而近几年来，相关学者围绕蛋白质的分离纯化技术进行了比较系统的研究，主要形成了如下几个方法。
1.1蛋白质分子大小差异的分离技术
1.1.1离心技术
主要是在机械运转的过程中，通过离心力使比重有差异的组分分离开来。离心技术也常常用于生化分离中，由于蛋白质的体积和密度是有差别的，离心力的差别会使蛋白质沉降分离开来[3,4]。通过离心以后，上清液中含有蛋白质，其余的成份沉淀下来。
1.1.2超滤技术
在一定的压力存在下，溶液中的小分子会以压力差为动力，能够透过一定孔径的薄膜，实现将大分子的物质与小分子的物质分离开来。在生物工程领域，具有一定分子量的蛋白质和核酸等可溶性生物大分子经常通过超滤的方法进行纯化或浓缩[5]。王娟等[6]利用超滤来去除重组MUCIMBP（在高效表达的麦芽糖结合蛋白的载体中按照正确的阅读框插入人类粘蛋白基因所构建的重组质粒，并且通过一系列的工艺得到的融合蛋白。）中内毒素的研究中发现，离子交换层析或离子交换层析结合疏水层析都不可以有效的消除内毒素，疏水层析对消除内毒素无作用。但是疏水层析通过与超滤的结合可有效消除内毒素，则超滤对于消除内毒素起着一定的重要作用。
1.1.3凝胶层析技术
也称分子筛过滤技术、排阻层析技术等。能够很好的分离高分子物质。凝胶层析是根据蛋白质的分子量大小差异的不同来对此进行分离的技术[7]。唐正江等[8]以蛋白的提取率为指标，使用孵化了15天的鸡胚为原料，确定了最佳提取鸡胚蛋白的条件,再经过葡聚糖G100凝胶过滤的方法对抗氧化能力较强的鸡胚蛋白进行分离纯化。得到的蛋白在小鼠体内具有良好的抗氧化能力。胡二坤等[9]在分离纯化玉米蛋白酶解产物时，研究了酶解产物在凝胶过滤色谱中的分离条件,最终确定了酶解产物在凝胶过滤色谱中的最好的实验条件。
1.1.4透析技术
此类技术是利用半透明的透析袋对大分子蛋白质进行处理，在一定程度上，能够将大分子融入透析袋中，然后利用置水的方式对其处理。Wenting Tang等[10]针对抗菌肽的靶向筛选，利用了平衡透析法从鳀鱼蒸煮废水水解液中分离抗菌肽。此研究表明脂质体平衡透析可用于抗菌肽的靶向筛选。Yuji Mano等[11]利用一种新的酪氨酸激酶抑制剂，研究了利用平衡透析法和液相色谱串联质谱法结合人血清蛋白。成功地进行了应用体内的蛋白结合高血清蛋白。
此类技术操作简单，除此之外，反复性能较好、试验品的生物活性也不易被改变。
1.2 蛋白质溶解度的分离技术
1.2.1溶剂法
有机溶剂具有一定的脱水效果，且其介电常数相对较小，致使其极性较小，有助于实现蛋白质分离纯化。傅冰等[12]对分离的卵转铁蛋白实验中使用了离子交换层析法和硫酸铵沉淀法，结果表明采用的这两种方法对于分离鸡蛋清中的卵转铁蛋白有较好的效果。在实际的使用过程中，要考虑到所需要的溶剂量，此外，溶剂不能全面的消除，残留的溶剂会导致药物出现分散的现象[13,14]。
1.2.2等电点法沉淀法
不同的蛋白质，它们的等电点是有差别的。通过蛋白质在加入具有等电点溶液时溶解度最低而析出的方法。孙雯等[15]在制备粗品酪蛋白时，通过联合凯氏定氮法与等电点沉淀法对制备技术参数进行了研究，得出了最佳酪蛋白提取参数。
1.2.3双水相萃取法
蛋白质在一些高分子的水溶液（如聚乙二醇的硫酸盐水溶液，它的分子量达到几千至几万，可以分为两个水相）中的溶解度是有很大的分别。在蛋白质等水溶性的生物产品时可以使用双水相萃取的方法来进行分离 [16,17]。王家权等[18]在对纯化藻蓝蛋白时使用了粉末活性炭吸附与双水相萃取联合的工艺方法，再通过使用单因素与正交试验,确定了粉末活性炭吸附联合双水相萃取法纯化蛋白的最优工艺条件，与传统的方法比较，该试验工艺使用周期较短、实验成本低、使用设备小等特点。闻崇炜等[19]纯化蛋清溶菌酶实验中使用聚乙纯化二醇(Polyethylene Glycol，PEG)沉淀法结合PEG硫酸铵双水相萃取体系。该法简便易行,易于放大,生物安全性高。
目录
1 引言 1
1.1 蛋白质分子大小差异的分离技术 1
1.2蛋白质溶解度的分离技术 2
1.3 蛋白质电荷不同的分离技术 3
1.4 蛋白质在固定金属离子亲和色谱中分离 4
2 课题研究目的及内容 5
2.1课题研究的目的 5
2.2课题研究的内容 5
2.3工艺流程图 6
3实验方法 6
3.1实验材料和设备 6
3.2金属螯合树脂吸附牛血清蛋白的工艺优化 7
3.3咪唑解析溶液的考察 8
3.4 金属螯合树脂在粗多糖中的应用 9
4结果与分析 10
4.1金属螯合树脂吸附牛血清蛋白的实验结果分析 10
4.2咪唑解析溶液的分析 12
4.3金属螯合树脂在粗多糖中的结果分析 14
结论 17
致谢 18
参考文献 19
引言
蛋白质是一类复杂有机大分子总称，作为生物体含量丰富、功能复杂、种类繁多的生物大分子，是生命活动的物质基础，在人体内发挥特异的生物学作用[1,2]。因此，蛋白质是解开人类对于生物体研究的一枚关键钥匙。
自从蛋白质被 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
发现以来，人们一直对蛋白质进行研究，而在蛋白质的研究和应用的过程中，往往需要提取出比较纯的蛋白质有机物，这就涉及了蛋白质的分离处理。
但是根据现有的技术来说，分离纯化并不容易，并且难度也比较大，成本也高。因此这方面的研究亟需改良和创新。而近几年来，相关学者围绕蛋白质的分离纯化技术进行了比较系统的研究，主要形成了如下几个方法。
1.1蛋白质分子大小差异的分离技术
1.1.1离心技术
主要是在机械运转的过程中，通过离心力使比重有差异的组分分离开来。离心技术也常常用于生化分离中，由于蛋白质的体积和密度是有差别的，离心力的差别会使蛋白质沉降分离开来[3,4]。通过离心以后，上清液中含有蛋白质，其余的成份沉淀下来。
1.1.2超滤技术
在一定的压力存在下，溶液中的小分子会以压力差为动力，能够透过一定孔径的薄膜，实现将大分子的物质与小分子的物质分离开来。在生物工程领域，具有一定分子量的蛋白质和核酸等可溶性生物大分子经常通过超滤的方法进行纯化或浓缩[5]。王娟等[6]利用超滤来去除重组MUCIMBP（在高效表达的麦芽糖结合蛋白的载体中按照正确的阅读框插入人类粘蛋白基因所构建的重组质粒，并且通过一系列的工艺得到的融合蛋白。）中内毒素的研究中发现，离子交换层析或离子交换层析结合疏水层析都不可以有效的消除内毒素，疏水层析对消除内毒素无作用。但是疏水层析通过与超滤的结合可有效消除内毒素，则超滤对于消除内毒素起着一定的重要作用。
1.1.3凝胶层析技术
也称分子筛过滤技术、排阻层析技术等。能够很好的分离高分子物质。凝胶层析是根据蛋白质的分子量大小差异的不同来对此进行分离的技术[7]。唐正江等[8]以蛋白的提取率为指标，使用孵化了15天的鸡胚为原料，确定了最佳提取鸡胚蛋白的条件,再经过葡聚糖G100凝胶过滤的方法对抗氧化能力较强的鸡胚蛋白进行分离纯化。得到的蛋白在小鼠体内具有良好的抗氧化能力。胡二坤等[9]在分离纯化玉米蛋白酶解产物时，研究了酶解产物在凝胶过滤色谱中的分离条件,最终确定了酶解产物在凝胶过滤色谱中的最好的实验条件。
1.1.4透析技术
此类技术是利用半透明的透析袋对大分子蛋白质进行处理，在一定程度上，能够将大分子融入透析袋中，然后利用置水的方式对其处理。Wenting Tang等[10]针对抗菌肽的靶向筛选，利用了平衡透析法从鳀鱼蒸煮废水水解液中分离抗菌肽。此研究表明脂质体平衡透析可用于抗菌肽的靶向筛选。Yuji Mano等[11]利用一种新的酪氨酸激酶抑制剂，研究了利用平衡透析法和液相色谱串联质谱法结合人血清蛋白。成功地进行了应用体内的蛋白结合高血清蛋白。
此类技术操作简单，除此之外，反复性能较好、试验品的生物活性也不易被改变。
1.2 蛋白质溶解度的分离技术
1.2.1溶剂法
有机溶剂具有一定的脱水效果，且其介电常数相对较小，致使其极性较小，有助于实现蛋白质分离纯化。傅冰等[12]对分离的卵转铁蛋白实验中使用了离子交换层析法和硫酸铵沉淀法，结果表明采用的这两种方法对于分离鸡蛋清中的卵转铁蛋白有较好的效果。在实际的使用过程中，要考虑到所需要的溶剂量，此外，溶剂不能全面的消除，残留的溶剂会导致药物出现分散的现象[13,14]。
1.2.2等电点法沉淀法
不同的蛋白质，它们的等电点是有差别的。通过蛋白质在加入具有等电点溶液时溶解度最低而析出的方法。孙雯等[15]在制备粗品酪蛋白时，通过联合凯氏定氮法与等电点沉淀法对制备技术参数进行了研究，得出了最佳酪蛋白提取参数。
1.2.3双水相萃取法
蛋白质在一些高分子的水溶液（如聚乙二醇的硫酸盐水溶液，它的分子量达到几千至几万，可以分为两个水相）中的溶解度是有很大的分别。在蛋白质等水溶性的生物产品时可以使用双水相萃取的方法来进行分离 [16,17]。王家权等[18]在对纯化藻蓝蛋白时使用了粉末活性炭吸附与双水相萃取联合的工艺方法，再通过使用单因素与正交试验,确定了粉末活性炭吸附联合双水相萃取法纯化蛋白的最优工艺条件，与传统的方法比较，该试验工艺使用周期较短、实验成本低、使用设备小等特点。闻崇炜等[19]纯化蛋清溶菌酶实验中使用聚乙纯化二醇(Polyethylene Glycol，PEG)沉淀法结合PEG硫酸铵双水相萃取体系。该法简便易行,易于放大,生物安全性高。
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