不同基源威灵仙药材的鉴别研究(附件)
本论文采用切片和粉末两种显微鉴别方法对四个产地、七个批次的威灵仙药材基源进行鉴别研究。通过考察切片组织结构、粉末结构、染色与脱色条件、粉末粒径对显微观测结果的影响，优化建立了切片和粉末显微鉴别方法为番红染色30分钟；脱色时滴加1-2滴5%稀盐酸；选择粉末粒径为80-100目；粉末制片时先滴液再铺平。切片显微可观察到威灵仙的外皮层细胞切向延长、棉团铁线莲和东北铁线莲的外皮层细胞径向延长，而粉末显微可观察到不同基源的威灵仙药材在石细胞和纤维束数量上的差异。结合药典标准鉴定七批威灵仙药材，一批为棉团铁线莲，两批为威灵仙，四批为东北铁线莲。研究结果表明，应用切片显微与粉末显微相结合的方法鉴别威灵仙基源，操作简单，观测结果直观准确，对现有药典的显微鉴别方法是一个有力的补充。关键词 毛茛科植物，威灵仙，基源鉴别，切片显微，粉末显微
目 录
1 引言 1
1.1 威灵仙概述 1
1.2 威灵仙鉴别研究现状 1
1.3 论文研究目的和意义 5
2 实验部分 5
2.1 实验仪器与试剂 6
2.2 药材来源 6
2.3 实验方法 7
3 结果与讨论 9
3.1 实验条件优化 9
3.2 切片鉴别结果分析 11
3.3 粉末鉴别结果分析 15
结论 19
致谢 20
参考文献 21
1 引言
1.1 威灵仙概述
威灵仙为双子叶植物毛茛科铁线莲属植物。2015年版《中国药典》规定正品威灵仙为毛茛科威灵仙、棉团铁线莲或东北铁线莲的干燥根及根茎，其分布广泛、种类繁多且化学成分复杂，在临床上具有通络止痛、治疗风湿痹痛、屈伸不利的功效，具有很好的研究和药用价值。
1.2 威灵仙鉴别研究现状
威灵仙作为常用中药被发现有混伪品在市场上流通，给临床应用带来巨大隐患，因此许多学者致力于寻找正品威灵仙的鉴别方法[1~3]。
1.2.1 性状鉴别
2015年版《中国药典》中对威灵仙三种基源的性状作出了详细描述[4]：
威灵仙：根茎为柱状；表 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
面呈淡棕黄色；质坚韧，断面呈纤维性；下侧有多数细根。根为细长圆柱形，稍弯曲；表面呈黑褐色且有细纵纹，偶有皮部脱落，；质硬脆且容易折断，断面部分较广，木部为淡黄色，呈类方形，皮部与木部间常有裂隙。药材气微味淡。
棉团铁线莲：根茎为短柱状；根表面棕褐色至棕黑色；断面木部呈圆形。药材味咸。
东北铁线莲：根茎呈柱状。根较密集；表面为棕黑色；断面木部呈类圆形。药材味辛辣。
通过对比上述三种基源药材的性状特征，发现药材的特征区别并不十分明显，可作为初步鉴别，但也存在不确定性和较大误差。
1.2.2 显微鉴别
2015年版《中国药典》中采用切片显微鉴别的方法对威灵仙药材的根横切面进行观察，总结出以下结构特征：
威灵仙：表皮细胞外壁增厚，呈棕黑色。皮层宽且均为薄壁细胞，外皮层细胞切向延长。韧皮部外侧常有纤维束和石细胞，纤维直径18～43 μm。形成层明显。木质部全部木化。薄壁细胞含淀粉粒。
棉团铁线莲：外皮层细胞多径向延长，紧接外皮层的1～2列细胞壁稍增厚，内皮层不明显。韧皮部外侧无纤维束和石细胞。
东北铁线莲：外皮层细胞径向延长，内皮层不明显，老根略切向延长。韧皮部外侧偶有纤维和石细胞。
显微鉴别方法是通过制作药材横截面切片，观察组织结构特征、组织细胞分布特点等区分所属基源。如图1。
//
a b
图1 威灵仙根横切面显微照片
1、表皮 2、皮层 3、韧皮部 4、木质部 5、石细胞
由图可以看出两种基源的威灵仙药材区别较为明显，图1中的a代表的基源切片内皮层的薄壁细胞为切向延长；韧皮部有大量纤维束和石细胞。b代表的基源切片则呈现不同特征，其内皮层的薄壁细胞为径向延长；韧皮部未见明显纤维束和石细胞。通过与《中国药典》中威灵仙药材相关显微特征相比较，可以得出呈现图a特征的药材基源为威灵仙，呈现图b特征的为东北铁线莲。通过对不同基源威灵仙药材的横切面组织构造特征的比较[5]，得出各类药材的区别。因此，显微鉴别可以作为不同基源威灵仙药材的一种有效鉴别方法。
在2015年版《中国药典》规定方法中，显微鉴别不同基源威灵仙的主要区别在于外皮层细胞延长方式不同，韧皮部有无纤维束和石细胞，外皮层的细胞壁是否增厚等。在具体操作中，并没有明确规定药材浸泡时间、染色时间等，需要多次实验探索。在徒手切片时，由于实验条件的限制，往往难以保证切片的厚度，影响显微观察。
1.2.3 理化鉴别
威灵仙类药材除了具有较多的挥发性成分以外还具有皂苷类化合物、生物碱和黄酮类等[6]。不同基源的威灵仙类药材所含有的化学物质有一定差别，因此可通过其理化性质的差异来鉴别。其中普遍运用的有薄层色谱法、液相色谱质谱联用、紫外谱线组法。
1．薄层色谱鉴别
《中国药典》中还记载了采用薄层色谱法鉴别药材是否属于威灵仙。实验先后将药材用乙醇加热回流，盐酸水解，石油醚提取，取残渣溶于无水乙醇作供试品，齐墩果酸为对照品分别点于薄层板上，结果显示，两个样品在薄层板的相应位置上显相同颜色斑点。表明该药材含有齐墩果酸。
王曙[7]等人也通过实验验证了《中国药典》方法的可行性，同时提出用氯仿萃取、溶解和以氯仿石油醚为展开剂，可以得到更高的齐墩果酸含量。钟宝恒[8]在此基础上对薄层色谱的前处理进行了改进，采用超声提取法，节约了时间和溶剂且方法稳定性好，快速便捷。
薄层色谱法在鉴别药材是否属于威灵仙时，可以提供参考。但是，在鉴别威灵仙药材的所属基源时，由于三种正品威灵仙中都含有一定量的齐墩果酸，因此不适合作为鉴别药典中三种基源威灵仙药材的依据。
2．液相色谱质谱联用
目 录
1 引言 1
1.1 威灵仙概述 1
1.2 威灵仙鉴别研究现状 1
1.3 论文研究目的和意义 5
2 实验部分 5
2.1 实验仪器与试剂 6
2.2 药材来源 6
2.3 实验方法 7
3 结果与讨论 9
3.1 实验条件优化 9
3.2 切片鉴别结果分析 11
3.3 粉末鉴别结果分析 15
结论 19
致谢 20
参考文献 21
1 引言
1.1 威灵仙概述
威灵仙为双子叶植物毛茛科铁线莲属植物。2015年版《中国药典》规定正品威灵仙为毛茛科威灵仙、棉团铁线莲或东北铁线莲的干燥根及根茎，其分布广泛、种类繁多且化学成分复杂，在临床上具有通络止痛、治疗风湿痹痛、屈伸不利的功效，具有很好的研究和药用价值。
1.2 威灵仙鉴别研究现状
威灵仙作为常用中药被发现有混伪品在市场上流通，给临床应用带来巨大隐患，因此许多学者致力于寻找正品威灵仙的鉴别方法[1~3]。
1.2.1 性状鉴别
2015年版《中国药典》中对威灵仙三种基源的性状作出了详细描述[4]：
威灵仙：根茎为柱状；表 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
面呈淡棕黄色；质坚韧，断面呈纤维性；下侧有多数细根。根为细长圆柱形，稍弯曲；表面呈黑褐色且有细纵纹，偶有皮部脱落，；质硬脆且容易折断，断面部分较广，木部为淡黄色，呈类方形，皮部与木部间常有裂隙。药材气微味淡。
棉团铁线莲：根茎为短柱状；根表面棕褐色至棕黑色；断面木部呈圆形。药材味咸。
东北铁线莲：根茎呈柱状。根较密集；表面为棕黑色；断面木部呈类圆形。药材味辛辣。
通过对比上述三种基源药材的性状特征，发现药材的特征区别并不十分明显，可作为初步鉴别，但也存在不确定性和较大误差。
1.2.2 显微鉴别
2015年版《中国药典》中采用切片显微鉴别的方法对威灵仙药材的根横切面进行观察，总结出以下结构特征：
威灵仙：表皮细胞外壁增厚，呈棕黑色。皮层宽且均为薄壁细胞，外皮层细胞切向延长。韧皮部外侧常有纤维束和石细胞，纤维直径18～43 μm。形成层明显。木质部全部木化。薄壁细胞含淀粉粒。
棉团铁线莲：外皮层细胞多径向延长，紧接外皮层的1～2列细胞壁稍增厚，内皮层不明显。韧皮部外侧无纤维束和石细胞。
东北铁线莲：外皮层细胞径向延长，内皮层不明显，老根略切向延长。韧皮部外侧偶有纤维和石细胞。
显微鉴别方法是通过制作药材横截面切片，观察组织结构特征、组织细胞分布特点等区分所属基源。如图1。
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a b
图1 威灵仙根横切面显微照片
1、表皮 2、皮层 3、韧皮部 4、木质部 5、石细胞
由图可以看出两种基源的威灵仙药材区别较为明显，图1中的a代表的基源切片内皮层的薄壁细胞为切向延长；韧皮部有大量纤维束和石细胞。b代表的基源切片则呈现不同特征，其内皮层的薄壁细胞为径向延长；韧皮部未见明显纤维束和石细胞。通过与《中国药典》中威灵仙药材相关显微特征相比较，可以得出呈现图a特征的药材基源为威灵仙，呈现图b特征的为东北铁线莲。通过对不同基源威灵仙药材的横切面组织构造特征的比较[5]，得出各类药材的区别。因此，显微鉴别可以作为不同基源威灵仙药材的一种有效鉴别方法。
在2015年版《中国药典》规定方法中，显微鉴别不同基源威灵仙的主要区别在于外皮层细胞延长方式不同，韧皮部有无纤维束和石细胞，外皮层的细胞壁是否增厚等。在具体操作中，并没有明确规定药材浸泡时间、染色时间等，需要多次实验探索。在徒手切片时，由于实验条件的限制，往往难以保证切片的厚度，影响显微观察。
1.2.3 理化鉴别
威灵仙类药材除了具有较多的挥发性成分以外还具有皂苷类化合物、生物碱和黄酮类等[6]。不同基源的威灵仙类药材所含有的化学物质有一定差别，因此可通过其理化性质的差异来鉴别。其中普遍运用的有薄层色谱法、液相色谱质谱联用、紫外谱线组法。
1．薄层色谱鉴别
《中国药典》中还记载了采用薄层色谱法鉴别药材是否属于威灵仙。实验先后将药材用乙醇加热回流，盐酸水解，石油醚提取，取残渣溶于无水乙醇作供试品，齐墩果酸为对照品分别点于薄层板上，结果显示，两个样品在薄层板的相应位置上显相同颜色斑点。表明该药材含有齐墩果酸。
王曙[7]等人也通过实验验证了《中国药典》方法的可行性，同时提出用氯仿萃取、溶解和以氯仿石油醚为展开剂，可以得到更高的齐墩果酸含量。钟宝恒[8]在此基础上对薄层色谱的前处理进行了改进，采用超声提取法，节约了时间和溶剂且方法稳定性好，快速便捷。
薄层色谱法在鉴别药材是否属于威灵仙时，可以提供参考。但是，在鉴别威灵仙药材的所属基源时，由于三种正品威灵仙中都含有一定量的齐墩果酸，因此不适合作为鉴别药典中三种基源威灵仙药材的依据。
2．液相色谱质谱联用
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