桦菌芝多糖提取工艺研究(附件)
摘 要桦菌芝是一种疗效明确的民间用药，可用于治疗胃癌、子宫癌、道癌等病，在陕西省乃至全国都有比较高的蕴藏量。多数资料表明，桦菌芝抗癌的物质基础为其多糖类成分。目前对桦菌芝的研究主要集中在抗癌作用及其机制方面，对于桦菌芝化学成分的提取、分离纯化研究以及质量标准研究的报道较少。本课题利用响应面分析法对桦菌芝多糖的提取工艺进行研究,在单因素实验基础上选取实验因素与水平,根据中心组合( Box-Benhnken) 实验设计原理采用3因素3水平的响应面分析法,依据回归分析确定各工艺条件的影响因子,以多糖提取率为响应值作响应面和等高线。在分析各个因素的显著性和交互作用后,得出其最佳水浸提条件为：温度84℃，时间为2.3h，料液比1:32。在此条件下，桦菌芝多糖的提取率可达11.12%。本课题的研究结论为桦菌芝资源的进一步开发利用提供了科学依据。 目 录
1 绪论
1.1 研究背景 1
1.2 研究意义 1
1.3 桦菌芝的概述 2
1.3.1 生物形态学特征及分布 2
1.3.2 化学成分 2
1.3.3 药理作用 3
1.4 菌多糖的提取方法 3
1.4.1 水浸提法 3
1.4.2 酶提取法 4
1.4.3 超声提取技术 4
1.4.4 微波辅助浸提法 4
2 实验部分
2.1 材料与试剂 5
2.2 仪器 5
2.3 桦菌芝多糖含量及提取率的测定 5
2.4 实验条件的确定 5
2.4.1 最大吸收波长的确定 5
2.4.2 苯酚添加量的考察 5
2.4.3 硫酸添加量的考察 6
2.4.4 水浴时间的考察 6
2.4.5 反应温度的确定 6
2.5 方法学考察 7
2.5.1 标准曲线的绘制 7
2.5.2 样品中多糖含量测定 7
2.5.3 仪器精密度 7
2.5.4 重现性 8
2.5.5 稳定性 8
2.5.6 加样回收率 8
2.6 单因素对桦
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
4.4 水浴时间的考察 6
2.4.5 反应温度的确定 6
2.5 方法学考察 7
2.5.1 标准曲线的绘制 7
2.5.2 样品中多糖含量测定 7
2.5.3 仪器精密度 7
2.5.4 重现性 8
2.5.5 稳定性 8
2.5.6 加样回收率 8
2.6 单因素对桦菌芝多糖提取率的影响 9
2.6.1 提取温度对桦菌芝多糖提取率的影响 9
2.6.2 提取时间对桦菌芝多糖提取率的影响 10
2.6.3 料液比对桦菌芝多糖提取率的影响 10
2.7 桦菌芝多糖提取工艺优化 11
2.7.1 响应面分析因素及水平设定 11
2.7.2 响应面分析与实验结果 12
结论 16
参考文献 17
致谢 22
1绪论
1.1 研究背景
我国在利用与开发天然药物方面的历史己经有数千年了。近几年,因为人类生存环境每况愈下的持续恶化,大量出现一些药源性疾病和疑难病。人们从天然界中发现具有高效低毒的特点的治病活性化合物,进而人们越来越青睐研究天然药物[1]。自然界中现存大约有2025万种真菌,真菌资源在我国颇为丰富,经记载已超过540种真菌在传统药用及试验验证是具有药效的[23]。
药用真菌不仅对疾病有预防、抑制或治疗作用，而且人体也有保健作用[45],大型药用真菌目前约有300多种,已开发利用的大型药用真菌只有2030种[6]。真菌人药在我历史悠久，早在《神农本草经》就有记载灵芝、雷丸、、茯苓等真菌的药效，其具有抗肿瘤、抗病毒、抗血小板凝聚等活性[7]。20世纪中期,科学家发现几种药用真菌提取物对S180细胞的生长有明显抑制作用，引发各界科学家对药用真菌抗肿瘤活性成分的注意[810]。传统观念认为多糖是药用真菌主要抗肿瘤组分[1113]。因此,从真菌中开发具有低毒高效且资源充足可持续开发的药物前景良好[1415]。真菌多糖在近年研究也有较大的进展，多数处于实验阶段，与国外相比仍有一定的差距[1617]。经实验表明真菌多糖化合物具有增强与调节免疫疗效[1820]、抗肿瘤疗效[2124]、抗病毒疗效[25]、抗凝血疗效[26]、抗衰老疗效[27]，对真菌多糖增强免疫机制的研究深入到分子和受体水平[28]。王思芦等人对真菌多糖进行研究，并综述了食用真菌多糖对机体免疫功能的影响及其作用机理,为进一步开发利用我国丰富的食用菌资源提供依据。
桦菌芝其性平,味微苦,水煎服,治小儿积食,药用有很好的消积化癖作用。民间用于治疗胃癌、子宫癌、道癌等病。鉴于桦菌芝有特殊的作用，且目前对其化学成分的研究又少有报道，限制了对其产品的进一步开发，不利于产品附加值的提高。可以从化学资源的角度展开对其化学成分的系统研究。研究结果可增加人们对该真菌类化学成分的认识、化学资源的合理利用及真菌多孔菌科的化学分类均具有重要的理论意义和参考价值。
1.2 研究意义
近几年人类生存环境持续恶化,出现大量疾病，其中肿瘤疾病发病率日益增高，所以人类对药物的需求也增加。药用真菌多糖具有抗肿瘤作用，毒副作用低，越来越受到人们的重视[2930]。郭丽新等人研究桦菌芝多糖对肉瘤S180的影响，结果表明桦菌芝多糖对小鼠肉瘤S180有抑制作用,可下调小鼠S180瘤组织突变型p53基因表达[31]。对A/jia系小鼠艾式腹水癌也有显著的抑制作用；长期的临床应用表明，桦菌芝具有明显的抗癌疗效,有关资料显示，桦菌芝抗癌作用的物质基础主要为其多糖类成分[3234]。桦菌芝在陕西省乃至全国都有比较高的蕴藏量，本项目旨在筛选出桦菌芝多糖的最佳提取工艺条件,以期用较低的成本得到含量较高的桦菌芝多糖，为桦菌芝资源的开发利用特别是新制剂或新药的研发奠定基础；在此基础上，还可进一步出开发拥有自主知识产权的肿瘤放、化疗毒副作用治疗的创新药物。
1.3 桦菌芝的概述
1.3.1 生物形态学特征及分布
桦菌芝(Phropolyporus fomentarius)，又名木蹄、木蹄层孔菌、小驴蹄子，为真菌多孔菌科褐层孔属植物木蹄的菌体。菌盖马蹄形，灰色，浅褐色至黑色，有厚角质皮壳和环状层纹，菌肉木栓质，锈色；菌管多层，层次不甚明显，每层厚3—5毫米，颜色较菌肉浅；管口圆形，灰色至浅褐色，每毫米3—4个；孢子长椭圆形，无色。多寄生于桦及栎的树干上，也生于杨、柳、赤杨、椴、榆等阔叶树的树干上。分布黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西、河南、陕西、甘肃、新疆、四川、贵州、云南、广西等地,前苏联亦产。
1.3.2 化学成分
桦菌芝为真菌多孔菌科褐层孔属植物木蹄的菌体。木蹄层孔菌化学成分主要包括萜类、苷类、氨基酸、氨基酸类，以及蛋白质、核苷酸有机酸、糖、脂类、色素类等。陆勇芹[35]等人,对木蹄层孔菌做了简单的化学成分系统预试,在水提取液、酸性乙醇提取液、甲醇提取液和乙醚提取液中主要检测到酚性成分、有机酸、糖、多糖和苷类、内酯、香豆素及其苷类、萜类化合物、植物甾醇及其苷类,并通过检测推断可能含有鞣质、黄酮类及其苷类。Florentyna wanda KudrzyckaBiexoszabska[36]对木蹄层孔菌的各类成分进行了定性显色检测,结果表明其子实体中含有甾醇、三萜、脂肪酸类和油脂类成分。singh,PrataP等人对木蹄层孔菌子实体的石油醚提取物、氯仿提取物和乙醇提取物进行了化学检识,结果发现木蹄层孔菌的子实体中含有麦角甾醇和麦角甾烷醇[37]。Rosecke,J.从木蹄层孔菌子实体中分离和鉴定出麦角甾醇过氧化物,麦角备甾7烯3酮[38]。Ahmedova,Z.P.分离得到木聚糖酶、漆酶和过氧化物酶三种酶[39]。Kapich,A.N.等人在木蹄层孔菌的菌丝中检测到8种磷脂成分:磷酸卵磷酯、脑磷酯、磷脂酰甘油、丝氨酸磷脂、磷脂酰肌醇、心肌磷脂、溶血磷脂胆碱、鞘磷脂[40]。Aoki,Michiko等人从木蹄层孔菌菌丝的摇床培养液中得到抗病毒的高分子多糖[41]。FAb.APalovic等人从木蹄层孔菌菌丝的培养液中得到联苯酚和二酚氧化酶[42]。FavreBonvin,Jean等人分离和鉴定出一种色素Anhydrofomentariol[43]。Gripenberg,Jarl等人分离和鉴定出化合物Dehydrofomentar
1 绪论
1.1 研究背景 1
1.2 研究意义 1
1.3 桦菌芝的概述 2
1.3.1 生物形态学特征及分布 2
1.3.2 化学成分 2
1.3.3 药理作用 3
1.4 菌多糖的提取方法 3
1.4.1 水浸提法 3
1.4.2 酶提取法 4
1.4.3 超声提取技术 4
1.4.4 微波辅助浸提法 4
2 实验部分
2.1 材料与试剂 5
2.2 仪器 5
2.3 桦菌芝多糖含量及提取率的测定 5
2.4 实验条件的确定 5
2.4.1 最大吸收波长的确定 5
2.4.2 苯酚添加量的考察 5
2.4.3 硫酸添加量的考察 6
2.4.4 水浴时间的考察 6
2.4.5 反应温度的确定 6
2.5 方法学考察 7
2.5.1 标准曲线的绘制 7
2.5.2 样品中多糖含量测定 7
2.5.3 仪器精密度 7
2.5.4 重现性 8
2.5.5 稳定性 8
2.5.6 加样回收率 8
2.6 单因素对桦
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
4.4 水浴时间的考察 6
2.4.5 反应温度的确定 6
2.5 方法学考察 7
2.5.1 标准曲线的绘制 7
2.5.2 样品中多糖含量测定 7
2.5.3 仪器精密度 7
2.5.4 重现性 8
2.5.5 稳定性 8
2.5.6 加样回收率 8
2.6 单因素对桦菌芝多糖提取率的影响 9
2.6.1 提取温度对桦菌芝多糖提取率的影响 9
2.6.2 提取时间对桦菌芝多糖提取率的影响 10
2.6.3 料液比对桦菌芝多糖提取率的影响 10
2.7 桦菌芝多糖提取工艺优化 11
2.7.1 响应面分析因素及水平设定 11
2.7.2 响应面分析与实验结果 12
结论 16
参考文献 17
致谢 22
1绪论
1.1 研究背景
我国在利用与开发天然药物方面的历史己经有数千年了。近几年,因为人类生存环境每况愈下的持续恶化,大量出现一些药源性疾病和疑难病。人们从天然界中发现具有高效低毒的特点的治病活性化合物,进而人们越来越青睐研究天然药物[1]。自然界中现存大约有2025万种真菌,真菌资源在我国颇为丰富,经记载已超过540种真菌在传统药用及试验验证是具有药效的[23]。
药用真菌不仅对疾病有预防、抑制或治疗作用，而且人体也有保健作用[45],大型药用真菌目前约有300多种,已开发利用的大型药用真菌只有2030种[6]。真菌人药在我历史悠久，早在《神农本草经》就有记载灵芝、雷丸、、茯苓等真菌的药效，其具有抗肿瘤、抗病毒、抗血小板凝聚等活性[7]。20世纪中期,科学家发现几种药用真菌提取物对S180细胞的生长有明显抑制作用，引发各界科学家对药用真菌抗肿瘤活性成分的注意[810]。传统观念认为多糖是药用真菌主要抗肿瘤组分[1113]。因此,从真菌中开发具有低毒高效且资源充足可持续开发的药物前景良好[1415]。真菌多糖在近年研究也有较大的进展，多数处于实验阶段，与国外相比仍有一定的差距[1617]。经实验表明真菌多糖化合物具有增强与调节免疫疗效[1820]、抗肿瘤疗效[2124]、抗病毒疗效[25]、抗凝血疗效[26]、抗衰老疗效[27]，对真菌多糖增强免疫机制的研究深入到分子和受体水平[28]。王思芦等人对真菌多糖进行研究，并综述了食用真菌多糖对机体免疫功能的影响及其作用机理,为进一步开发利用我国丰富的食用菌资源提供依据。
桦菌芝其性平,味微苦,水煎服,治小儿积食,药用有很好的消积化癖作用。民间用于治疗胃癌、子宫癌、道癌等病。鉴于桦菌芝有特殊的作用，且目前对其化学成分的研究又少有报道，限制了对其产品的进一步开发，不利于产品附加值的提高。可以从化学资源的角度展开对其化学成分的系统研究。研究结果可增加人们对该真菌类化学成分的认识、化学资源的合理利用及真菌多孔菌科的化学分类均具有重要的理论意义和参考价值。
1.2 研究意义
近几年人类生存环境持续恶化,出现大量疾病，其中肿瘤疾病发病率日益增高，所以人类对药物的需求也增加。药用真菌多糖具有抗肿瘤作用，毒副作用低，越来越受到人们的重视[2930]。郭丽新等人研究桦菌芝多糖对肉瘤S180的影响，结果表明桦菌芝多糖对小鼠肉瘤S180有抑制作用,可下调小鼠S180瘤组织突变型p53基因表达[31]。对A/jia系小鼠艾式腹水癌也有显著的抑制作用；长期的临床应用表明，桦菌芝具有明显的抗癌疗效,有关资料显示，桦菌芝抗癌作用的物质基础主要为其多糖类成分[3234]。桦菌芝在陕西省乃至全国都有比较高的蕴藏量，本项目旨在筛选出桦菌芝多糖的最佳提取工艺条件,以期用较低的成本得到含量较高的桦菌芝多糖，为桦菌芝资源的开发利用特别是新制剂或新药的研发奠定基础；在此基础上，还可进一步出开发拥有自主知识产权的肿瘤放、化疗毒副作用治疗的创新药物。
1.3 桦菌芝的概述
1.3.1 生物形态学特征及分布
桦菌芝(Phropolyporus fomentarius)，又名木蹄、木蹄层孔菌、小驴蹄子，为真菌多孔菌科褐层孔属植物木蹄的菌体。菌盖马蹄形，灰色，浅褐色至黑色，有厚角质皮壳和环状层纹，菌肉木栓质，锈色；菌管多层，层次不甚明显，每层厚3—5毫米，颜色较菌肉浅；管口圆形，灰色至浅褐色，每毫米3—4个；孢子长椭圆形，无色。多寄生于桦及栎的树干上，也生于杨、柳、赤杨、椴、榆等阔叶树的树干上。分布黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西、河南、陕西、甘肃、新疆、四川、贵州、云南、广西等地,前苏联亦产。
1.3.2 化学成分
桦菌芝为真菌多孔菌科褐层孔属植物木蹄的菌体。木蹄层孔菌化学成分主要包括萜类、苷类、氨基酸、氨基酸类，以及蛋白质、核苷酸有机酸、糖、脂类、色素类等。陆勇芹[35]等人,对木蹄层孔菌做了简单的化学成分系统预试,在水提取液、酸性乙醇提取液、甲醇提取液和乙醚提取液中主要检测到酚性成分、有机酸、糖、多糖和苷类、内酯、香豆素及其苷类、萜类化合物、植物甾醇及其苷类,并通过检测推断可能含有鞣质、黄酮类及其苷类。Florentyna wanda KudrzyckaBiexoszabska[36]对木蹄层孔菌的各类成分进行了定性显色检测,结果表明其子实体中含有甾醇、三萜、脂肪酸类和油脂类成分。singh,PrataP等人对木蹄层孔菌子实体的石油醚提取物、氯仿提取物和乙醇提取物进行了化学检识,结果发现木蹄层孔菌的子实体中含有麦角甾醇和麦角甾烷醇[37]。Rosecke,J.从木蹄层孔菌子实体中分离和鉴定出麦角甾醇过氧化物,麦角备甾7烯3酮[38]。Ahmedova,Z.P.分离得到木聚糖酶、漆酶和过氧化物酶三种酶[39]。Kapich,A.N.等人在木蹄层孔菌的菌丝中检测到8种磷脂成分:磷酸卵磷酯、脑磷酯、磷脂酰甘油、丝氨酸磷脂、磷脂酰肌醇、心肌磷脂、溶血磷脂胆碱、鞘磷脂[40]。Aoki,Michiko等人从木蹄层孔菌菌丝的摇床培养液中得到抗病毒的高分子多糖[41]。FAb.APalovic等人从木蹄层孔菌菌丝的培养液中得到联苯酚和二酚氧化酶[42]。FavreBonvin,Jean等人分离和鉴定出一种色素Anhydrofomentariol[43]。Gripenberg,Jarl等人分离和鉴定出化合物Dehydrofomentar
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