粘细菌抗菌活性菌株筛选及发酵条件优化
目录
1 引言 1
1.1 研究背景 1
1.2 研究意义 2
2 材料与方法 3
2.1 实验材料与仪器 3
2.2 实验方法 6
3 结果与讨论 9
3.1 粘细菌的分离筛选情况 9
3.2. 6株粘细菌的形态特征 11
3.3 粘细菌的初步筛选 12
3.4 Y4粘细菌菌株发酵代谢产物A的抗菌谱 12
3.5 Y4粘细菌菌株发酵代谢产物B的抗菌谱 13
3.6 粘细菌Y4的发酵条件优化 15
3.7 讨论 21
结论 22
致谢 23
参考文献 24
1引言
1.1研究背景
粘细菌是一类具有复杂的多细胞行为的革兰氏阴性细菌[1]，属于原核生物，在研究原核生物进化和细胞分化、发育中占有非常重要的地位[2]。如黄色粘细菌(Myxococcusxanthus)是研究粘细菌分化发育、多细胞行为及社会学行为的模式菌株[3]。
1809 年，德国植物学家 H.F.Link 首次发现了粘细菌(myxobacteria)并将其命名为Polyangium vitellinum；1857 年，英国生物学家 M.J.Berkeley 又发现了两个属种的粘细菌 Stigmatella aurantiaca和 Chondromyces crocatus，并根据发育学地位将它们归类为 Hyphomycetes[4]；1892 年美国植物学家Roland Thaxter发现了粘细菌的生活史[5]。
20世纪初开始，人们对粘细菌进行了几方面的研究。最初是对粘细菌进行富集培 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
养和纯培养等一般性研究，此后转向由Dworkin和Gibson提出的发育生物学研究，和Kaiser及其同事提出的分子遗传学研究[6]。黄色粘球菌成为粘细菌研究的重点模式材料，并且是目前研究得最为清楚的粘细菌。2001年2月开始，由加州大学伯克利分校的Kaiser实验室与孟山都公司[7]合作开展了黄色粘球菌的基因组测序（但在完成95%之后不知什么原因未能完成全序列测定）。另一个更新的领域是由Reichenbach和他的同事发现的粘细菌生物活性次级代谢产物方面。有关粘细菌次级代谢产物的研究是20世纪80年代才真正兴起，大部分工作是由Reichenbach领导的德国国家生物技术研究中心（GBF）的研究组完成的，其发现的粘细菌生物活性次级代谢产物大约占发现的全部粘细菌的次级代谢产物的90%以上[8]。
有关粘细菌研究大量集中在子实体的分化发育、细胞运动、信号传导等方面，目前工作全部以抱囊杆菌亚目的粘球菌(Myxococcus spp.)和橙色标桩菌(Stigematellasp p.)为模式材料开展。而堆囊菌亚目中能够降解纤维素的粘细菌类群是粘细菌中生物活性物质产生能力最高的类群。在标准培养条件下培养的微生物能够产生抑菌活性的概率（阳性菌率），链霉菌大约是80%，溶细菌类群粘细菌是55%，而溶纤维素类群粘细菌则大约为96%。由于溶纤维素粘细菌很难获得纯培养，因此与有关的研究，除了对其进行的生物活性化合物的筛选外，其它研究，例如：溶纤维素粘细菌不同菌株的分子分类，纤维素降解酶及降解纤维素机制，溶纤维素粘细菌的生态分布等方面很少，几乎为零。有关堆囊菌亚目的粘细菌在分化发育上的工作目前尚未开展。因此，开展有关溶纤维素粘细菌的基础研究，可为相关的研究和应用开发提供坚实的基础。
粘细菌不同于其它普通原核生物的最显著特征是其休眠性子实体的结构[9]。粘细菌的子实体一般可以明确地分为两个部分，一是不具有繁殖活性的结构部分，如孢子囊的壁、子实体的柄等；二是在孢子囊内发育成熟的具有繁殖活性的粘孢子。粘细菌的子实体有鲜艳的颜色，常可用肉眼识别。1809年，德国植物学家LinkH .F.发现并命名了第一株粘细菌，但将粘细菌的子实体误认为是真菌中的腹菌；1857年，英国生物学家M.J.Berkeley发现和命名了另两个种属的粘细菌——橙色标桩菌（Stigmatella aurantiaca）和藏红花软骨霉状菌（Chondromyces crocatus），但将它们归于真菌的丝孢菌类群中；1892年，美国植物学家Roland Thaxter第一个将这些具有子实体的特殊微生物归于粘细菌（Myxobacteria），并描述了它们的生活周期。实际上，直到20世纪60年代仍有人将粘细菌报道为真菌。
1.2研究意义
绝大多数粘细菌可产生有生物活性的次级代谢产物，并具有以下特点:
①种类多，有聚醚类、大环内酯类、多烯类、聚酮类、内酰胺类、杂环类等及复合型化合物[10]；
②结构新颖，并且很多化合物是粘细菌所特有的；
③作用机制多样性；
④同一类菌株可产生具有一种基本结构的家族系列化合物；
⑤同一化合物可由不同属菌株产生，同属菌株也可产生完全不同的化合物，但很少有化合物同时在两个亚目菌株中产生；
⑥发酵条件优化后次级代谢产物的产量明显提高[11]；
目前对粘细菌的次级代谢产物的研究属德国国家生物技术中心(GBF)最为深入，目前报道已从700多株粘细菌中共分离到 100 多个新的母核结构及近 500 个衍生物[11]。
随着研究的不断深入，我们发现粘细菌能够产生多种抗细菌、抗真菌和抗肿瘤的活性物质[12]，其中抑真菌活性最为普遍，抑革兰氏阳性菌活性次之，抑革兰氏阴性和抑两性及抗昆虫活性和抗动物细胞活性的代谢产物则较少。但是合成能力有菌株特异性，因此需要建立大型的粘细菌库，作为依托平台来筛选有生物活性的分子。相同的菌株在一种培养基中可产生多种不同生物活性物质，在不同培养基里产生的活性物质也不一样；但不同种的粘细菌有时能产生相同生物活性物质[13]，这些都为筛选出新作用机制或新结构的物质奠定基础。
粘细菌的活性次级代谢产物在药源前体化合物的研究中占重要的地位，并取得了很好的成绩，很多活性代谢产物都表现出良好的抗肿瘤、抗菌效果[14]。目前世界上很多研究机构都对粘细菌的研究做出了很大贡献，但我国作为微生物资源大国，对于粘细菌的开发利用还有非常广阔的空间，对于粘细菌研究力度还有待加强，尤其是对其次生代谢产物的深入研究以及研究方法的改进和创新方面[15]。因此，加强对粘细菌不同种属次生代谢产物的研究以及次生代谢产物研究方法的改进[16]对粘细菌资源的开发和利用有巨大作用。
目前从放线菌等微生物中筛选抗生素的重复几率越来越高，而粘细菌在这方面具有独特的优势。就目前情况看，在溶细菌群粘细菌中50%的菌株可产生生物活性物质，而溶纤维素群粘细菌甚至高达96%[17]。这为新抗生素的筛选提供了很好的一类微生物资源。
本课题主要是对从土壤中分离出的粘细菌进行抗菌活性的筛选，再对筛选出的粘细菌进行发酵培养，提取发酵代谢产物，并测定其抗菌谱，以及不同的发酵条件对粘细菌发酵代谢产物活性的影响。
2 材料与方法
2.1 实验材料与仪器
2.1.1 实验材料
取自枚乘路校区的土样3份：柳树根下土样、杨树林土样、菜地土样。并从淮安市郊农家获得了家兔粪便和牛羊粪便。
1 引言 1
1.1 研究背景 1
1.2 研究意义 2
2 材料与方法 3
2.1 实验材料与仪器 3
2.2 实验方法 6
3 结果与讨论 9
3.1 粘细菌的分离筛选情况 9
3.2. 6株粘细菌的形态特征 11
3.3 粘细菌的初步筛选 12
3.4 Y4粘细菌菌株发酵代谢产物A的抗菌谱 12
3.5 Y4粘细菌菌株发酵代谢产物B的抗菌谱 13
3.6 粘细菌Y4的发酵条件优化 15
3.7 讨论 21
结论 22
致谢 23
参考文献 24
1引言
1.1研究背景
粘细菌是一类具有复杂的多细胞行为的革兰氏阴性细菌[1]，属于原核生物，在研究原核生物进化和细胞分化、发育中占有非常重要的地位[2]。如黄色粘细菌(Myxococcusxanthus)是研究粘细菌分化发育、多细胞行为及社会学行为的模式菌株[3]。
1809 年，德国植物学家 H.F.Link 首次发现了粘细菌(myxobacteria)并将其命名为Polyangium vitellinum；1857 年，英国生物学家 M.J.Berkeley 又发现了两个属种的粘细菌 Stigmatella aurantiaca和 Chondromyces crocatus，并根据发育学地位将它们归类为 Hyphomycetes[4]；1892 年美国植物学家Roland Thaxter发现了粘细菌的生活史[5]。
20世纪初开始，人们对粘细菌进行了几方面的研究。最初是对粘细菌进行富集培 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
养和纯培养等一般性研究，此后转向由Dworkin和Gibson提出的发育生物学研究，和Kaiser及其同事提出的分子遗传学研究[6]。黄色粘球菌成为粘细菌研究的重点模式材料，并且是目前研究得最为清楚的粘细菌。2001年2月开始，由加州大学伯克利分校的Kaiser实验室与孟山都公司[7]合作开展了黄色粘球菌的基因组测序（但在完成95%之后不知什么原因未能完成全序列测定）。另一个更新的领域是由Reichenbach和他的同事发现的粘细菌生物活性次级代谢产物方面。有关粘细菌次级代谢产物的研究是20世纪80年代才真正兴起，大部分工作是由Reichenbach领导的德国国家生物技术研究中心（GBF）的研究组完成的，其发现的粘细菌生物活性次级代谢产物大约占发现的全部粘细菌的次级代谢产物的90%以上[8]。
有关粘细菌研究大量集中在子实体的分化发育、细胞运动、信号传导等方面，目前工作全部以抱囊杆菌亚目的粘球菌(Myxococcus spp.)和橙色标桩菌(Stigematellasp p.)为模式材料开展。而堆囊菌亚目中能够降解纤维素的粘细菌类群是粘细菌中生物活性物质产生能力最高的类群。在标准培养条件下培养的微生物能够产生抑菌活性的概率（阳性菌率），链霉菌大约是80%，溶细菌类群粘细菌是55%，而溶纤维素类群粘细菌则大约为96%。由于溶纤维素粘细菌很难获得纯培养，因此与有关的研究，除了对其进行的生物活性化合物的筛选外，其它研究，例如：溶纤维素粘细菌不同菌株的分子分类，纤维素降解酶及降解纤维素机制，溶纤维素粘细菌的生态分布等方面很少，几乎为零。有关堆囊菌亚目的粘细菌在分化发育上的工作目前尚未开展。因此，开展有关溶纤维素粘细菌的基础研究，可为相关的研究和应用开发提供坚实的基础。
粘细菌不同于其它普通原核生物的最显著特征是其休眠性子实体的结构[9]。粘细菌的子实体一般可以明确地分为两个部分，一是不具有繁殖活性的结构部分，如孢子囊的壁、子实体的柄等；二是在孢子囊内发育成熟的具有繁殖活性的粘孢子。粘细菌的子实体有鲜艳的颜色，常可用肉眼识别。1809年，德国植物学家LinkH .F.发现并命名了第一株粘细菌，但将粘细菌的子实体误认为是真菌中的腹菌；1857年，英国生物学家M.J.Berkeley发现和命名了另两个种属的粘细菌——橙色标桩菌（Stigmatella aurantiaca）和藏红花软骨霉状菌（Chondromyces crocatus），但将它们归于真菌的丝孢菌类群中；1892年，美国植物学家Roland Thaxter第一个将这些具有子实体的特殊微生物归于粘细菌（Myxobacteria），并描述了它们的生活周期。实际上，直到20世纪60年代仍有人将粘细菌报道为真菌。
1.2研究意义
绝大多数粘细菌可产生有生物活性的次级代谢产物，并具有以下特点:
①种类多，有聚醚类、大环内酯类、多烯类、聚酮类、内酰胺类、杂环类等及复合型化合物[10]；
②结构新颖，并且很多化合物是粘细菌所特有的；
③作用机制多样性；
④同一类菌株可产生具有一种基本结构的家族系列化合物；
⑤同一化合物可由不同属菌株产生，同属菌株也可产生完全不同的化合物，但很少有化合物同时在两个亚目菌株中产生；
⑥发酵条件优化后次级代谢产物的产量明显提高[11]；
目前对粘细菌的次级代谢产物的研究属德国国家生物技术中心(GBF)最为深入，目前报道已从700多株粘细菌中共分离到 100 多个新的母核结构及近 500 个衍生物[11]。
随着研究的不断深入，我们发现粘细菌能够产生多种抗细菌、抗真菌和抗肿瘤的活性物质[12]，其中抑真菌活性最为普遍，抑革兰氏阳性菌活性次之，抑革兰氏阴性和抑两性及抗昆虫活性和抗动物细胞活性的代谢产物则较少。但是合成能力有菌株特异性，因此需要建立大型的粘细菌库，作为依托平台来筛选有生物活性的分子。相同的菌株在一种培养基中可产生多种不同生物活性物质，在不同培养基里产生的活性物质也不一样；但不同种的粘细菌有时能产生相同生物活性物质[13]，这些都为筛选出新作用机制或新结构的物质奠定基础。
粘细菌的活性次级代谢产物在药源前体化合物的研究中占重要的地位，并取得了很好的成绩，很多活性代谢产物都表现出良好的抗肿瘤、抗菌效果[14]。目前世界上很多研究机构都对粘细菌的研究做出了很大贡献，但我国作为微生物资源大国，对于粘细菌的开发利用还有非常广阔的空间，对于粘细菌研究力度还有待加强，尤其是对其次生代谢产物的深入研究以及研究方法的改进和创新方面[15]。因此，加强对粘细菌不同种属次生代谢产物的研究以及次生代谢产物研究方法的改进[16]对粘细菌资源的开发和利用有巨大作用。
目前从放线菌等微生物中筛选抗生素的重复几率越来越高，而粘细菌在这方面具有独特的优势。就目前情况看，在溶细菌群粘细菌中50%的菌株可产生生物活性物质，而溶纤维素群粘细菌甚至高达96%[17]。这为新抗生素的筛选提供了很好的一类微生物资源。
本课题主要是对从土壤中分离出的粘细菌进行抗菌活性的筛选，再对筛选出的粘细菌进行发酵培养，提取发酵代谢产物，并测定其抗菌谱，以及不同的发酵条件对粘细菌发酵代谢产物活性的影响。
2 材料与方法
2.1 实验材料与仪器
2.1.1 实验材料
取自枚乘路校区的土样3份：柳树根下土样、杨树林土样、菜地土样。并从淮安市郊农家获得了家兔粪便和牛羊粪便。
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