凹叶厚朴内生真菌代谢产物抗真菌活性的研究(附件)
摘 要本实验主要以陕西汉中凹叶厚朴为材料，采用微生物发酵的方法对代谢产物厚朴酚的内生真菌进行液体发酵培养，提取菌丝、菌液中的活性代谢产物，研究其代谢产物抗真菌活性，从而了解凹叶厚朴内生真菌的抗菌范围。一方面寻找新的活性成分以解决药源匮乏问题，另一方面为凹叶厚朴内生真菌的抗菌活性研究提供理论基础。本实验对凹叶厚朴内生真菌代谢产物进行抗真菌活性检测，通过实验得出：内生真菌YX-24号对鞭孢霉菌(Whip spore mildew genera)、粘帚霉菌(Stick with mildew genera)、曲霉菌(Aspergillus)有抗菌活性，对卵型孢霉菌(Egg type spore mildew genera)、拟黑根霉菌(Guling rhizpus genus)、囊孢菌(Capsule spore bacteria genera)抗菌活性不明显。其中对鞭孢霉菌(Whip spore mildew genera)、粘帚霉菌(Stick with mildew genera)有抗菌活性现象，观察较明显；对曲霉菌(Aspergillus)有抗菌效果，但抗菌现象不明显。所以说明凹叶厚朴内生真菌代谢产物有抗真菌活性。通过对凹叶厚朴内生真菌代谢产物的活性研究，深入了解凹叶厚朴中所含内生真菌的抗菌活性，丰富了凹叶厚朴内生真菌代谢产物的抗菌谱，为后续研究凹叶厚朴内生真菌所具有的药用价值及凹叶厚朴药理作用提供理论依据。目 录
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴的研究现状 1
1.2 植物内生真菌的研究 1
1.3 生物活性 2
1.3.1 抗肿瘤活性 2
1.3.2 抗菌活性 2
1.3.3 抗氧化活性 3
1.3.4 免疫抑制活性 3
1.3.5 其他生物活性 3
1.4 植物内生真菌代谢产物的前景 3
1.5 小结 4
2 实验部分
2.1 菌种 5
2.2 实验药品及试剂 5
2.2.1 实验器材 5
2.2.2 培养基的制备 6
2.3 试验方法 6
2.3.1 菌种的复壮
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
> 1.3.5 其他生物活性 3
1.4 植物内生真菌代谢产物的前景 3
1.5 小结 4
2 实验部分
2.1 菌种 5
2.2 实验药品及试剂 5
2.2.1 实验器材 5
2.2.2 培养基的制备 6
2.3 试验方法 6
2.3.1 菌种的复壮及对照品溶液制备 6
2.3.2 菌种的收藏 7
2.4 抗菌实验 7
2.5 实验结果与分析 7
2.6 结果分析 13
结论 15
参考文献 17
致谢 19
文献综述
凹叶厚朴的研究现状
厚朴来源于木兰科植物厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils)或凹叶厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils)的干燥皮、树皮和枝皮。厚朴(Magnolia officinalis)是常用的一味中药它有行气燥湿、降逆平喘的功效，产自四川、湖北、湖南、浙江、福建、重庆、贵州、陕西、广西、江西等地[1]。厚朴的采集主要是以砍树剥皮的方式进行采集，这种采集方式对厚朴的资源、生态资源和生态环境都产生非常大的破坏和浪费。近年来对厚朴的过度砍伐已导致厚朴更加稀缺。目前药材市场上流通的厚朴大多为人工种植的厚朴。厚朴因为它的采集方式的限制，人们大量的采集厚朴药材导致其资源减少，虽然现在已经有人工种植厚朴，但厚朴药材的药用资源还是不足，植物内生真菌能产生与宿主相同或相似的化学成分，厚朴的资源紧缺得到了一定程度上的解决。笔者查阅资料后发现关于凹叶厚朴内生真菌代谢产物的抗真菌活性的研究较少。
植物内生真菌的研究
植物内生真菌(Endophytic fungus)[2]代谢产物十分丰富。有研究表明，内生真菌几乎广泛存于所有植物体内[3]。有些内生真菌能够促进宿主的生长发育[4]。如产紫衫醇的内生真菌[5]。药用植物的内生真菌受到人们的重视[6]。内生真菌与宿主的共生特性对其资源短缺的问题有很大的帮助[7]。植物内生真菌里存在着很多生物机制，对医用植物药材的领域有很大的意义。
关于植物内生真菌代谢产物的研究是最近几年才开始的[8]。植物内生真菌代谢产物已成现代药用植物使用领域的一个重要的研究[9]。内生真菌的代谢产物能够刺激和促进生物的生长发育。张集慧等[10]从5种发育的内生真菌的研究表明内生真菌为碳水化合物的一个储库，能迅速地将蔗糖转变成植物不能代谢的糖醇[11]，如在干旱胁迫下内生真菌感染对黑麦草进行实验的研究[12]。李桂玲等[13]从三尖杉、南方红豆杉及香榧中分离出的172株内生真菌中有90株对植物病原真菌，黄花蒿和蒙吉蒿茎中的内生真菌，其发酵物中含有炭疽菌酸(co1letoeion acid)等3种有抑菌活性的新化合物[14]。
内生真菌广泛存在于植物体内，高宁等[15]从狭叶柴胡根、茎、叶中共分离得到内生真菌。内生真菌主要由子囊及其无性型组成，对内生真菌的分析表明，内植物内一样具有广泛的种属分布和数据优势。
生物活性
抗肿瘤活性
药用植物内生真菌代谢产物种类有很多种，根据它的不同作用机制，在各个方面都有其重要的药用价值，在其作用机制范围中生物活性方面尤为重要[16]。近年来有很多关于内生真菌的代谢产物抗肿瘤的活性研究，如Stierle等于1993年第一次从短叶紫衫的树皮中成功分离出1株通过抑制微管解聚和稳定微管作用而产生对卵巢癌、乳腺癌、直肠癌等。还有国内的很多关于内生真菌的抗性机制研究都研究出了具有显著的紫衫醇和其他紫衫烷类化合物的内生真菌Taxomyces andreanae[17]。Yang等[18]从长春花中成功分离了出通过内生真菌的代谢产物的干扰癌细胞纺锤体形成使细胞有丝分裂。内生真菌的代谢产物对抗肿瘤活性方面的作用是医学领域将要深入了解的一个研究，对医学方面来说植物内生真菌的抗肿瘤活性是非常有价值的研究。
抗菌活性
关于内生真菌代谢产物的抗菌方面来说，这是一个新型实验研究的一个突破口，内生真菌能与宿主共存并且能与宿主产生相同或相似的化学成分，这不仅对贵重药材的浪费和有效成分的提取效率都有很大的改变，Geraldo等[19]从美丽决明的拟茎点霉属内生真菌发酵液中得到5个杜松烷倍半萜且活性与制霉素的相当。Sumarah等从五针松中分离出五株内生真菌，药理活性表明该植物内生真菌的代谢产物具有抗酿酒酵母菌的活性。仝保慧等[20]对内生真菌的分离鉴定及药理学活性的分析的研究确定了内生真菌的抗菌活性，其实还有很多我们不清楚不了解的菌种的考验在等待着我们，植物内生真菌在新型菌的抗菌研究方面有着举足轻重的作用。
抗氧化活性
史佳琴等[21]对槐树的12株内生真菌总抗氧化活性进行了检测。研究表明，此12株槐树内生真菌均呈现不同程度的抗氧化活性。抗氧化对于食品、药品等来说都有非常大的研究价值，它可以增长食品的保质期，可以减少浪费、节约资源、可以保存易氧化的贵重药品，减少损失。
免疫抑制活性
免疫抑制剂是一类对机体免疫反应具有抑制作用的活性物质。已经有研究人员完成关于免疫抑制活性，研究表明植物内生真菌代谢产物有表现免疫抑制活性的机制[22]。阙东枚[23]的关于免疫抑制的研究说明人体接种疫苗是为了免疫其相应的病菌，让机体在病菌对机体造成病菌伤害之前就将某种病菌免疫，此时
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴的研究现状 1
1.2 植物内生真菌的研究 1
1.3 生物活性 2
1.3.1 抗肿瘤活性 2
1.3.2 抗菌活性 2
1.3.3 抗氧化活性 3
1.3.4 免疫抑制活性 3
1.3.5 其他生物活性 3
1.4 植物内生真菌代谢产物的前景 3
1.5 小结 4
2 实验部分
2.1 菌种 5
2.2 实验药品及试剂 5
2.2.1 实验器材 5
2.2.2 培养基的制备 6
2.3 试验方法 6
2.3.1 菌种的复壮
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
> 1.3.5 其他生物活性 3
1.4 植物内生真菌代谢产物的前景 3
1.5 小结 4
2 实验部分
2.1 菌种 5
2.2 实验药品及试剂 5
2.2.1 实验器材 5
2.2.2 培养基的制备 6
2.3 试验方法 6
2.3.1 菌种的复壮及对照品溶液制备 6
2.3.2 菌种的收藏 7
2.4 抗菌实验 7
2.5 实验结果与分析 7
2.6 结果分析 13
结论 15
参考文献 17
致谢 19
文献综述
凹叶厚朴的研究现状
厚朴来源于木兰科植物厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils)或凹叶厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils)的干燥皮、树皮和枝皮。厚朴(Magnolia officinalis)是常用的一味中药它有行气燥湿、降逆平喘的功效，产自四川、湖北、湖南、浙江、福建、重庆、贵州、陕西、广西、江西等地[1]。厚朴的采集主要是以砍树剥皮的方式进行采集，这种采集方式对厚朴的资源、生态资源和生态环境都产生非常大的破坏和浪费。近年来对厚朴的过度砍伐已导致厚朴更加稀缺。目前药材市场上流通的厚朴大多为人工种植的厚朴。厚朴因为它的采集方式的限制，人们大量的采集厚朴药材导致其资源减少，虽然现在已经有人工种植厚朴，但厚朴药材的药用资源还是不足，植物内生真菌能产生与宿主相同或相似的化学成分，厚朴的资源紧缺得到了一定程度上的解决。笔者查阅资料后发现关于凹叶厚朴内生真菌代谢产物的抗真菌活性的研究较少。
植物内生真菌的研究
植物内生真菌(Endophytic fungus)[2]代谢产物十分丰富。有研究表明，内生真菌几乎广泛存于所有植物体内[3]。有些内生真菌能够促进宿主的生长发育[4]。如产紫衫醇的内生真菌[5]。药用植物的内生真菌受到人们的重视[6]。内生真菌与宿主的共生特性对其资源短缺的问题有很大的帮助[7]。植物内生真菌里存在着很多生物机制，对医用植物药材的领域有很大的意义。
关于植物内生真菌代谢产物的研究是最近几年才开始的[8]。植物内生真菌代谢产物已成现代药用植物使用领域的一个重要的研究[9]。内生真菌的代谢产物能够刺激和促进生物的生长发育。张集慧等[10]从5种发育的内生真菌的研究表明内生真菌为碳水化合物的一个储库，能迅速地将蔗糖转变成植物不能代谢的糖醇[11]，如在干旱胁迫下内生真菌感染对黑麦草进行实验的研究[12]。李桂玲等[13]从三尖杉、南方红豆杉及香榧中分离出的172株内生真菌中有90株对植物病原真菌，黄花蒿和蒙吉蒿茎中的内生真菌，其发酵物中含有炭疽菌酸(co1letoeion acid)等3种有抑菌活性的新化合物[14]。
内生真菌广泛存在于植物体内，高宁等[15]从狭叶柴胡根、茎、叶中共分离得到内生真菌。内生真菌主要由子囊及其无性型组成，对内生真菌的分析表明，内植物内一样具有广泛的种属分布和数据优势。
生物活性
抗肿瘤活性
药用植物内生真菌代谢产物种类有很多种，根据它的不同作用机制，在各个方面都有其重要的药用价值，在其作用机制范围中生物活性方面尤为重要[16]。近年来有很多关于内生真菌的代谢产物抗肿瘤的活性研究，如Stierle等于1993年第一次从短叶紫衫的树皮中成功分离出1株通过抑制微管解聚和稳定微管作用而产生对卵巢癌、乳腺癌、直肠癌等。还有国内的很多关于内生真菌的抗性机制研究都研究出了具有显著的紫衫醇和其他紫衫烷类化合物的内生真菌Taxomyces andreanae[17]。Yang等[18]从长春花中成功分离了出通过内生真菌的代谢产物的干扰癌细胞纺锤体形成使细胞有丝分裂。内生真菌的代谢产物对抗肿瘤活性方面的作用是医学领域将要深入了解的一个研究，对医学方面来说植物内生真菌的抗肿瘤活性是非常有价值的研究。
抗菌活性
关于内生真菌代谢产物的抗菌方面来说，这是一个新型实验研究的一个突破口，内生真菌能与宿主共存并且能与宿主产生相同或相似的化学成分，这不仅对贵重药材的浪费和有效成分的提取效率都有很大的改变，Geraldo等[19]从美丽决明的拟茎点霉属内生真菌发酵液中得到5个杜松烷倍半萜且活性与制霉素的相当。Sumarah等从五针松中分离出五株内生真菌，药理活性表明该植物内生真菌的代谢产物具有抗酿酒酵母菌的活性。仝保慧等[20]对内生真菌的分离鉴定及药理学活性的分析的研究确定了内生真菌的抗菌活性，其实还有很多我们不清楚不了解的菌种的考验在等待着我们，植物内生真菌在新型菌的抗菌研究方面有着举足轻重的作用。
抗氧化活性
史佳琴等[21]对槐树的12株内生真菌总抗氧化活性进行了检测。研究表明，此12株槐树内生真菌均呈现不同程度的抗氧化活性。抗氧化对于食品、药品等来说都有非常大的研究价值，它可以增长食品的保质期，可以减少浪费、节约资源、可以保存易氧化的贵重药品，减少损失。
免疫抑制活性
免疫抑制剂是一类对机体免疫反应具有抑制作用的活性物质。已经有研究人员完成关于免疫抑制活性，研究表明植物内生真菌代谢产物有表现免疫抑制活性的机制[22]。阙东枚[23]的关于免疫抑制的研究说明人体接种疫苗是为了免疫其相应的病菌，让机体在病菌对机体造成病菌伤害之前就将某种病菌免疫，此时
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