中药连翘中总黄酮的含量鉴定(附件)
目的黄酮作为一类重要的中药有效成分，具有抗氧化、抗心血管、抗抑郁、抗菌、抗炎等多个方面的成效，在含量的测定方法与限度控制是中药及其制剂质量标准的重要内容。方法本实验主要是采用的超声波法辅助有机溶剂甲醇来提取连翘提取液中的总黄酮，对提取温度、提取时间、以及料液比进行单因素试验，最终采用紫外分光光度法来测定总黄酮的含量。此外，以总黄酮提取率为指标，在单因素实验的基础上，使用响应面法来优化超声提取的条件。结果连翘中总黄酮最佳提取工艺条件提取温度40°C，提取时间50 min，料液比为114时，连翘中总黄酮提取率达到3.12%。结论使用响应面法分析结果可靠，能够得到提取连翘中总黄酮的最佳提取工艺。关键词 连翘，总黄酮，含量，紫外分光光度法，响应面法
目 录
1 引言 2
2 连翘总黄酮 2
3 常用提取方法 4
4 总黄酮常用含量测定方法 6
4.1 紫外分光光度法 6
4.2 DPPH清除法 7
4.3 其他 7
5 本课题研究内容与目的 7
6 实验部分 8
6.1 实验仪器与药品 8
6.2 连翘中总黄酮的提取 8
6.3 标准曲线的制定 8
6.4 超声辅助法提取总黄酮最佳条件的确定 9
6.5 响应面法确定最佳实验条件 11
结 论 16
致谢 17
参考文献 18
1 引言
连翘作为常用中药，在《中国药典》早已收载，为木犀科连翘属。贯叶连翘为金丝桃科金丝桃属的草本植物，该植物在欧洲具有悠长的应用历史，是作为在国际医药市场中最重要抗抑郁植物的制剂原料，但该属贯以“连翘”的植物有13种以上[1]。贯叶连翘在民间使用了大约两千多年，且分布的范围较广，现代医学证明黄酮类成分的研究价值较高。目前，野生连翘居多，而且资源有限，而大部分连翘叶的资源并没有得到充分的开发与利用。在中药连翘中的总黄酮含量测定与提取方案的优化，本文不作区别，以两种科系植物为主要研究对象进行实验方案的优化。本文归纳了这些成分的分离及纯化和含量测定技术的研究进展情况，为改进提取纯化的工艺提供研究 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
基础。并由此建立了用于连翘中黄酮类化学成分测定的紫外分光光度法。
2 连翘总黄酮
2.1 化学组成成分
连翘提取物成分比较复杂，不同成分的药理活性不相同，成分之间的协同作用也可用在某些疾病的治疗。其中有机酸主要包括有槲皮素、异槲皮素、木犀草苷、山柰酚、异鼠李素、芦丁、橙皮苷、木犀草素、异鼠李素3OαL吡喃鼠李糖苷（1→2）βD吡喃葡萄糖苷、翻白叶苷A、和金丝桃苷等[2]。
2.2 活性
大量的临床试验证明连翘中总黄酮对于中轻度抑郁症具有一定疗效，具有较小的副作用。在传统中医学眼中连翘性平，一般用于外伤出血，咳血，风湿骨痛等疾病的医治，而现代药理学的研究则表明黄酮类化合物主要具有以下几种活性。
2.2.1 抗氧化活性
利用连翘中总黄酮化合物对DPPH的清除能力的测定评价其抗氧化活性[3]。连翘花、果实和叶提取物都具有较强的抗氧化活性。连翘花、叶提取物中主要抗氧化活性成分是总黄酮，连翘果实中主要抗氧化活性成分是总黄酮和连翘酯苷。
2.2.2 抗抑郁及抗焦虑
随着时代发展，社会竞争激烈，每个社会成员都会承担各式各样的心理压力，随之产生心理焦虑甚至抑郁，抑郁症成为当今社会的常见病，因此全球对于黄酮类化合物的研究范围越来越广。在德国，提出将金丝桃素与蛋白结合，可以用来医治艾滋病或者甲、乙型肝炎。而市场上要求贯叶连翘提取成分中的金丝桃素的含量值 ≥ 0.3%。近来的研究中证明黄酮类成分则是贯叶连翘中具有抗抑郁作用的有效成分之一[4]。
2.2.3 抗心血管疾病
连翘中的黄酮类化合物可调节血脂，抑制血栓和扩张冠状动脉。它们主要通过抑制凝血酶和血小板活化因子来引导血小板聚集并阻止血栓素的释放。研究表明类黄酮能降低甘油三酯（TG），总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL）水平，并增加高密度脂蛋白（HDL）水平[5]。黄酮苷类是连翘中的有效成分，能显著扩张冠状动脉的同时增加血流量，改善心肌养分，降低心肌耗氧量，直接作用在外周血管平滑肌上，使得血管扩张，能进一步降低血压。
2.2.4 抗疲劳作用
将从连翘叶中提取的黄酮类的化合物为研究对象，对一次性的运动损伤以小鼠模型的抗疲劳作用的研究。
实验采用乙醇回流提取和聚酰胺柱层析法获得连翘叶黄酮，将75只ICR的雄性小鼠，每组15只随机分为5组，分别分成为安静对照组和运动对照组。力竭游泳后恢复24小时，取其中的40只，对其眼球进行采血并取下肝脏、心脏、脑和股四头肌，分别检测血液中血红蛋白、血糖、血清尿素氮、血乳酸的含量和CAT的活性，检测肝脏和股四头肌的糖原含量，检测肝脏、心脏、脑和股四头肌中的MDA含量和SOD及肝脏和心脏的Cu/ZnSOD活力，另外35只取其肝脏和心肌分别对其进行Cu/ZnSOD的免疫组化染色观测，且对不同动物的肝脏、心肌和股四头肌，在其同一组织的同一部位取材[6]。?
2.2.5 亚硝酸盐清除作用[7]
连翘黄酮类化合物和VC去除亚硝酸盐的实验结果如图1所示。连翘花中总黄酮的浓度和清除率呈对数关系，总黄酮浓度为8.00 μg/ ml。在96.00 μg/ ml时，清除率从（27.69 ± 2.10）%逐渐增加至最大清除率（96.08 ± 0.90）%；连翘试验液中成分的IC50值（IC50：清除率）为50%。 当黄酮类化合物浓度为18.05 μg/ml时，连翘总黄酮可有效去除亚硝酸盐。
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图1 连翘花及VC对亚硝酸盐清除效果
3 常用提取方法
当前，随着社会对于黄酮类化合物中存在的多种生物活性的了解，研究及证明，对此类化合物的提取以及分离方法进行了更加深入的研究，最终能够优化实验所需技术和方法。而常用于连翘中的总黄酮的提取方法主要是水提取法、醇渗漉法、醇回流法、浸渍法、碱液提取法、以及超声辅助萃取法等。不同的提取方法会采用不同的提取溶剂或试剂及仪器，主要应用分类有以下几种。
3.1 超声波提取法
超声提取法主要是利用超声波对提取材料的空化作用，加速药材中某些化学有效成分快速溶解，而超声波法一般辅助有机溶剂进行提取。本实验则是采用超声波法辅助有机溶剂甲醇进行提取。
路剑等[8]不断试验优化提取条件，首先准确称取1 g的连翘干粉，放在100 mL的烧杯中，并加入60%的乙醇25 mL，随后超声处理使融化，随后进行过滤，将所得到的样液用100 ml的容量瓶来进行定容。最终得到的连翘中总黄酮，使用超声波法最佳的提取工艺是功率为700 W，频率达到100 kHz，温度设为60°C，超声时间40 min。
目 录
1 引言 2
2 连翘总黄酮 2
3 常用提取方法 4
4 总黄酮常用含量测定方法 6
4.1 紫外分光光度法 6
4.2 DPPH清除法 7
4.3 其他 7
5 本课题研究内容与目的 7
6 实验部分 8
6.1 实验仪器与药品 8
6.2 连翘中总黄酮的提取 8
6.3 标准曲线的制定 8
6.4 超声辅助法提取总黄酮最佳条件的确定 9
6.5 响应面法确定最佳实验条件 11
结 论 16
致谢 17
参考文献 18
1 引言
连翘作为常用中药，在《中国药典》早已收载，为木犀科连翘属。贯叶连翘为金丝桃科金丝桃属的草本植物，该植物在欧洲具有悠长的应用历史，是作为在国际医药市场中最重要抗抑郁植物的制剂原料，但该属贯以“连翘”的植物有13种以上[1]。贯叶连翘在民间使用了大约两千多年，且分布的范围较广，现代医学证明黄酮类成分的研究价值较高。目前，野生连翘居多，而且资源有限，而大部分连翘叶的资源并没有得到充分的开发与利用。在中药连翘中的总黄酮含量测定与提取方案的优化，本文不作区别，以两种科系植物为主要研究对象进行实验方案的优化。本文归纳了这些成分的分离及纯化和含量测定技术的研究进展情况，为改进提取纯化的工艺提供研究 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
基础。并由此建立了用于连翘中黄酮类化学成分测定的紫外分光光度法。
2 连翘总黄酮
2.1 化学组成成分
连翘提取物成分比较复杂，不同成分的药理活性不相同，成分之间的协同作用也可用在某些疾病的治疗。其中有机酸主要包括有槲皮素、异槲皮素、木犀草苷、山柰酚、异鼠李素、芦丁、橙皮苷、木犀草素、异鼠李素3OαL吡喃鼠李糖苷（1→2）βD吡喃葡萄糖苷、翻白叶苷A、和金丝桃苷等[2]。
2.2 活性
大量的临床试验证明连翘中总黄酮对于中轻度抑郁症具有一定疗效，具有较小的副作用。在传统中医学眼中连翘性平，一般用于外伤出血，咳血，风湿骨痛等疾病的医治，而现代药理学的研究则表明黄酮类化合物主要具有以下几种活性。
2.2.1 抗氧化活性
利用连翘中总黄酮化合物对DPPH的清除能力的测定评价其抗氧化活性[3]。连翘花、果实和叶提取物都具有较强的抗氧化活性。连翘花、叶提取物中主要抗氧化活性成分是总黄酮，连翘果实中主要抗氧化活性成分是总黄酮和连翘酯苷。
2.2.2 抗抑郁及抗焦虑
随着时代发展，社会竞争激烈，每个社会成员都会承担各式各样的心理压力，随之产生心理焦虑甚至抑郁，抑郁症成为当今社会的常见病，因此全球对于黄酮类化合物的研究范围越来越广。在德国，提出将金丝桃素与蛋白结合，可以用来医治艾滋病或者甲、乙型肝炎。而市场上要求贯叶连翘提取成分中的金丝桃素的含量值 ≥ 0.3%。近来的研究中证明黄酮类成分则是贯叶连翘中具有抗抑郁作用的有效成分之一[4]。
2.2.3 抗心血管疾病
连翘中的黄酮类化合物可调节血脂，抑制血栓和扩张冠状动脉。它们主要通过抑制凝血酶和血小板活化因子来引导血小板聚集并阻止血栓素的释放。研究表明类黄酮能降低甘油三酯（TG），总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL）水平，并增加高密度脂蛋白（HDL）水平[5]。黄酮苷类是连翘中的有效成分，能显著扩张冠状动脉的同时增加血流量，改善心肌养分，降低心肌耗氧量，直接作用在外周血管平滑肌上，使得血管扩张，能进一步降低血压。
2.2.4 抗疲劳作用
将从连翘叶中提取的黄酮类的化合物为研究对象，对一次性的运动损伤以小鼠模型的抗疲劳作用的研究。
实验采用乙醇回流提取和聚酰胺柱层析法获得连翘叶黄酮，将75只ICR的雄性小鼠，每组15只随机分为5组，分别分成为安静对照组和运动对照组。力竭游泳后恢复24小时，取其中的40只，对其眼球进行采血并取下肝脏、心脏、脑和股四头肌，分别检测血液中血红蛋白、血糖、血清尿素氮、血乳酸的含量和CAT的活性，检测肝脏和股四头肌的糖原含量，检测肝脏、心脏、脑和股四头肌中的MDA含量和SOD及肝脏和心脏的Cu/ZnSOD活力，另外35只取其肝脏和心肌分别对其进行Cu/ZnSOD的免疫组化染色观测，且对不同动物的肝脏、心肌和股四头肌，在其同一组织的同一部位取材[6]。?
2.2.5 亚硝酸盐清除作用[7]
连翘黄酮类化合物和VC去除亚硝酸盐的实验结果如图1所示。连翘花中总黄酮的浓度和清除率呈对数关系，总黄酮浓度为8.00 μg/ ml。在96.00 μg/ ml时，清除率从（27.69 ± 2.10）%逐渐增加至最大清除率（96.08 ± 0.90）%；连翘试验液中成分的IC50值（IC50：清除率）为50%。 当黄酮类化合物浓度为18.05 μg/ml时，连翘总黄酮可有效去除亚硝酸盐。
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图1 连翘花及VC对亚硝酸盐清除效果
3 常用提取方法
当前，随着社会对于黄酮类化合物中存在的多种生物活性的了解，研究及证明，对此类化合物的提取以及分离方法进行了更加深入的研究，最终能够优化实验所需技术和方法。而常用于连翘中的总黄酮的提取方法主要是水提取法、醇渗漉法、醇回流法、浸渍法、碱液提取法、以及超声辅助萃取法等。不同的提取方法会采用不同的提取溶剂或试剂及仪器，主要应用分类有以下几种。
3.1 超声波提取法
超声提取法主要是利用超声波对提取材料的空化作用，加速药材中某些化学有效成分快速溶解，而超声波法一般辅助有机溶剂进行提取。本实验则是采用超声波法辅助有机溶剂甲醇进行提取。
路剑等[8]不断试验优化提取条件，首先准确称取1 g的连翘干粉，放在100 mL的烧杯中，并加入60%的乙醇25 mL，随后超声处理使融化，随后进行过滤，将所得到的样液用100 ml的容量瓶来进行定容。最终得到的连翘中总黄酮，使用超声波法最佳的提取工艺是功率为700 W，频率达到100 kHz，温度设为60°C，超声时间40 min。
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