连翘中15种化合物的分离与鉴定二级医药(附件)
摘 要连翘 [Forsythia suspensa(Thunb)Vahl] 属木犀科植物，我国的传统中药，主要分布于我国的山西、河南、陕西、山东等地。性微寒，味苦。具有有清热解毒，散结消肿之效；用于治疗温热、丹毒、斑疹、痈疡肿毒、瘰疬、小便淋闭、清心火。现代药理研究认为，连翘抗菌、抗炎、解热、镇吐、利尿强心、抗肝损、镇痛、抑制磷酸二酯酶、抗内毒素等作用。连翘中化学成分主要为木脂素类、 黄酮类、苯乙醇苷类、天然醇类等多种生物活性成分。本文运用LC-MS法：Cosmosil 5C18-AR II色谱柱，流动相为磷酸溶液和甲醇-乙腈的混合溶液，检测波长为254或280 nm，在60 min内分离出15种化合物，通过匹配权威标准或文献数据中的紫外光谱和质谱信息确定峰的归属。15种成分的4个成分的校准曲线得到的浓度范围为2个数量级，并表现出良好的线性关系。重复性(RSD)的方法0.23-1.50%（组间）和0.41-2.40%（组内）。各组分的检测限(S/N=3)测定为0.16-0.27μg/mL。 目 录
1 绪论
1.1 研究背景 1
1.2 研究目的和意义 2
2 实验部分
2.1 试剂及材料 5
2.2 连翘药材提取物的制备方法 5
2.3 连翘药材提取物的检测方法 5
2.3.1 LCUV系统 5
2.3.2 LCMS系统 6
2.3.3 校准曲线和验证 6
2.4方法学考察 6
2.5实验结果及分析 8
2.5.1 HPLC和LCMS结果 8
2.5.2 HPLC和LCMS结果分析 8
2.5.3 LCMS结果 9
2.5.4 LCMS结果分析 10
2.5.5 连翘药材中各成分的含量测定 14
结 论 16
参考文献 17
致 谢 19
1 绪论
1.1 研究背景
连翘[Forsythia suspensa(Thunb)Vahl]属木犀科，连翘属落叶灌木植物，以果实入药，自1963年以来一直被中国药典收录。其性微寒，味苦，归肺、心、胆经，
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2.5.5 连翘药材中各成分的含量测定 14
结 论 16
参考文献 17
致 谢 19
1 绪论
1.1 研究背景
连翘[Forsythia suspensa(Thunb)Vahl]属木犀科，连翘属落叶灌木植物，以果实入药，自1963年以来一直被中国药典收录。其性微寒，味苦，归肺、心、胆经，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热的功效，临床常用于急性风热感冒、痈肿疮毒、淋巴结核、尿路感染等症，中医素有疮家圣药”之称[1]。我国盛产连翘，其资源丰富、成分复杂、生物活性多样，不仅是临床常用的中药材，也是许多中成药的重要原料，还可用于食品、化妆品。
连翘始载于《神农本草经》，连翘的应用始自宋代，多以果实入药，并逐渐成为全国药用连翘的主流品种。我国连翘资源比较丰富，华北黄土高原是其分布中心，连翘虽有较多栽培，但大多作为城市绿化和观赏树[2]。目前，药材商品主要来源于野生资源，主要分布于秦岭山脉中部、东部和太行山西麓，呈丁字形分布。从主产区资源和历史收购情况来看，山西省约占全国的40%，河南占30%，陕西占20% 左右，其余主要分布于湖南、湖北、宁夏、甘肃、河北、山东、辽宁等省，近年来，我国除华南地区外，其他各地均有少量栽培，另外，朝鲜和日本等国家也有零星分布[3]。山西是野生连翘资源分布的中心，主要分布于中条山、太岳山、太行山南部和吕梁山的南部，蕴藏量5000吨，年收购量2500吨[4]。商品连翘有“青翘”和“老翘”之分。秋季果实初熟尚带绿色时采收，习称“青翘”，多未开裂，表面绿褐色，质硬。种子多在果实熟透时采收，习称“老翘”，多开裂成两瓣，表面黄棕色或红棕色，质脆，种子多已脱落，内表面浅黄棕色，习惯认为老翘优于青翘，老翘为主流品种，传统上乘的老翘多为医院配方和出口，而中成药生产企业和连翘提取加工企业则常采用青翘为原料[5]。
连翘中含多种化学成分，连翘化学成分方面的研究较为系统。目前，已从连翘中分离得到多种化合物，包括苯乙醇苷类、木脂素类、萜类及黄酮类等。(1)苯乙醇苷类：苯乙醇及其苷类化合物是连翘的主要特征性有效成分之一。现已从连翘中分离得到连翘酯苷A、B、C、D、E、F、连翘酚、异连翘酯苷、caleolarioside A、plantainoside A、suspensaside A、suspensaside B、毛柳苷、β羟基泽丁香酚苷、泽丁香酚苷、木通苯乙醇苷B、4二羟基苯乙基8OβD葡萄糖苷等。(2)木脂素类：木脂素及其苷类是连翘中较早被认识的一类活性成分，包括连翘苷、连翘脂素、(+)—表松脂素、异落叶松脂素、异橄榄脂素、异落叶松脂素4OβD葡萄糖苷、异落叶松脂素9OβD葡萄糖苷、calceolarioside B、松脂素单甲基醚4OβD葡萄糖苷、7羟基松脂素、8羟基松脂素、dimethylmatairesinol、forsythialan A、forsythialan B、cedrusin、落叶松脂素、牛蒡酚、牛蒡子苷、罗汉松酯素、罗汉松苷、二甲基罗汉松酯素。(3)黄酮类：黄酮类化合物包括槲皮素、异槲皮素、芦丁、紫云英苷、汉黄芩素7OβD葡萄糖醛酸苷[6]。(4)挥发油和萜类挥发油主要存在于连翘种子中，含量平均可达3.8%，且多数为单萜、单萜醇和倍半萜类化合物，其中含量较多的有α蒎烯、β蒎烯、伞花烃、芳樟醇、水芹烯、对聚伞花烯、松油烯4醇、柠檬烯、孟二烯等。连翘中还含有三萜、环烯醚萜类化合物。其中三萜类成分有齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸、2α羟基白桦脂酸、2α，23 羟基熊果酸 、3β乙酰基20, 25环氧达玛烷24α醇、3β乙酰基20,25环氧达玛烷24β醇、β香树脂醇乙酸酯、20s达玛烷24烯3β，20二醇3乙酸酯、20s，24s环氧达玛烷25醇3α羟基乙酸酯等，环烯醚萜苷类。(5)生物碱类：包括suspensine A、7Omethylegenine、egenine、bicuculline等异喹啉类生物碱。(6)有机酸及甾醇类：从连翘果实中分离出硬脂酸、棕榈酸、丁二酸、香荚兰酸、棕搁酸、琥珀酸、咖啡酸、对羟基苯乙酸甲酯、咖啡酸甲酯、原儿茶酸等有机酸类和β谷甾醇、胡萝卜苷等甾醇类化合物[7]。
1.2 研究目的和意义
连翘具有丰富的化学成分，近年来随着连翘中化合物的药理作用被发现，进一步对连翘的化学成分和分析方法进行研究,找到活性更好的成分、建立快速的控制连翘质量的方法意义重大。因此结合生物活性、药理学等研究，对连翘植物进行深入系统的化学成分分离，为寻找新药做出贡献。本文采用LCMS方法来进行连翘中15种化合物的分离与鉴定。
连翘中化合物的药理作用，(1)抗菌、抗病毒作用：连翘具有广谱抗菌作用，对多种革兰阳性菌、阴性菌均有抑制作用。其煎剂的最低抑菌浓度(MIC) 分别为：肺炎双球菌3.75 mg/mL1、金黄色葡萄球菌3 mg/ mL1、白喉杆菌7.5 mg/mL1。连翘种子挥发油在体外对多种细菌均有较强的抗菌作用，其中以对金黄色葡萄球菌的作用最强，且作用稳定而持久。连翘有效成分连翘酯苷具有极强的抗菌、抗病毒活性，其对金黄色葡萄球菌的抑制作用比四环素还强，是迄今为止连翘属植物中发现的抗菌活性最强的成分之一，为中药连翘的主要特征性成分。连翘酚对金黄色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌也有一定的抑菌作用。连翘还可直接破坏内毒素结构。(2)抗炎作用：连翘的甲醇提取物有明显的抗炎活性，其中的牛蒡苷元是主要的活性中介物质，有显著的抗炎和止痛作用，在急性炎症动物实验模型中，可以抑制毛细管通透性的增加、补充发炎组织中的白血球。连翘醇提物腹腔注射有非常明显的抗渗出作用及降低炎性部位血管壁脆性作用，对炎性屏障的形成无抑制作用，P32标记红细胞实验表明连翘能促进炎性屏障的形成。用人工方法给大白鼠复制无菌性肉芽囊模型，腹腔注射连翘液有抗渗出作用，未见抗增生作用。注射连翘液的大白鼠，其血中P32标记红细胞渗入“炎性肉芽囊”内的红细胞数量明显地减少，表明该连翘有降低炎症病灶区微血管壁脆[8]。(3)抗氧化作用：连翘果实和连翘叶的乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取部分均有较强的抗氧化活性。给予连翘提取物的老鼠，15天后与阴性对照组相比血浆中的肿瘤坏死因子α、白介素β和白介素6都有明显降低。连翘花提取物通过清除活性氧自由基和提高抗氧化酶活力保护线粒体。此外，异连翘酯苷、连翘酯苷A和连翘苷对DPPH 自由基均有一定的清除作用，前2种物质的抗氧化能力大大优于连翘苷，是新的天然抗氧化剂。连翘苷和8羟基松脂素对过氧硝基引起的细胞损害有抵抗作用[9]。(4)保肝作用：连翘煎剂能明显降低大鼠皮下注射四氯化碳引起的血清谷丙转氨酶及碱性磷酸
1 绪论
1.1 研究背景 1
1.2 研究目的和意义 2
2 实验部分
2.1 试剂及材料 5
2.2 连翘药材提取物的制备方法 5
2.3 连翘药材提取物的检测方法 5
2.3.1 LCUV系统 5
2.3.2 LCMS系统 6
2.3.3 校准曲线和验证 6
2.4方法学考察 6
2.5实验结果及分析 8
2.5.1 HPLC和LCMS结果 8
2.5.2 HPLC和LCMS结果分析 8
2.5.3 LCMS结果 9
2.5.4 LCMS结果分析 10
2.5.5 连翘药材中各成分的含量测定 14
结 论 16
参考文献 17
致 谢 19
1 绪论
1.1 研究背景
连翘[Forsythia suspensa(Thunb)Vahl]属木犀科，连翘属落叶灌木植物，以果实入药，自1963年以来一直被中国药典收录。其性微寒，味苦，归肺、心、胆经，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
0
2.5.5 连翘药材中各成分的含量测定 14
结 论 16
参考文献 17
致 谢 19
1 绪论
1.1 研究背景
连翘[Forsythia suspensa(Thunb)Vahl]属木犀科，连翘属落叶灌木植物，以果实入药，自1963年以来一直被中国药典收录。其性微寒，味苦，归肺、心、胆经，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热的功效，临床常用于急性风热感冒、痈肿疮毒、淋巴结核、尿路感染等症，中医素有疮家圣药”之称[1]。我国盛产连翘，其资源丰富、成分复杂、生物活性多样，不仅是临床常用的中药材，也是许多中成药的重要原料，还可用于食品、化妆品。
连翘始载于《神农本草经》，连翘的应用始自宋代，多以果实入药，并逐渐成为全国药用连翘的主流品种。我国连翘资源比较丰富，华北黄土高原是其分布中心，连翘虽有较多栽培，但大多作为城市绿化和观赏树[2]。目前，药材商品主要来源于野生资源，主要分布于秦岭山脉中部、东部和太行山西麓，呈丁字形分布。从主产区资源和历史收购情况来看，山西省约占全国的40%，河南占30%，陕西占20% 左右，其余主要分布于湖南、湖北、宁夏、甘肃、河北、山东、辽宁等省，近年来，我国除华南地区外，其他各地均有少量栽培，另外，朝鲜和日本等国家也有零星分布[3]。山西是野生连翘资源分布的中心，主要分布于中条山、太岳山、太行山南部和吕梁山的南部，蕴藏量5000吨，年收购量2500吨[4]。商品连翘有“青翘”和“老翘”之分。秋季果实初熟尚带绿色时采收，习称“青翘”，多未开裂，表面绿褐色，质硬。种子多在果实熟透时采收，习称“老翘”，多开裂成两瓣，表面黄棕色或红棕色，质脆，种子多已脱落，内表面浅黄棕色，习惯认为老翘优于青翘，老翘为主流品种，传统上乘的老翘多为医院配方和出口，而中成药生产企业和连翘提取加工企业则常采用青翘为原料[5]。
连翘中含多种化学成分，连翘化学成分方面的研究较为系统。目前，已从连翘中分离得到多种化合物，包括苯乙醇苷类、木脂素类、萜类及黄酮类等。(1)苯乙醇苷类：苯乙醇及其苷类化合物是连翘的主要特征性有效成分之一。现已从连翘中分离得到连翘酯苷A、B、C、D、E、F、连翘酚、异连翘酯苷、caleolarioside A、plantainoside A、suspensaside A、suspensaside B、毛柳苷、β羟基泽丁香酚苷、泽丁香酚苷、木通苯乙醇苷B、4二羟基苯乙基8OβD葡萄糖苷等。(2)木脂素类：木脂素及其苷类是连翘中较早被认识的一类活性成分，包括连翘苷、连翘脂素、(+)—表松脂素、异落叶松脂素、异橄榄脂素、异落叶松脂素4OβD葡萄糖苷、异落叶松脂素9OβD葡萄糖苷、calceolarioside B、松脂素单甲基醚4OβD葡萄糖苷、7羟基松脂素、8羟基松脂素、dimethylmatairesinol、forsythialan A、forsythialan B、cedrusin、落叶松脂素、牛蒡酚、牛蒡子苷、罗汉松酯素、罗汉松苷、二甲基罗汉松酯素。(3)黄酮类：黄酮类化合物包括槲皮素、异槲皮素、芦丁、紫云英苷、汉黄芩素7OβD葡萄糖醛酸苷[6]。(4)挥发油和萜类挥发油主要存在于连翘种子中，含量平均可达3.8%，且多数为单萜、单萜醇和倍半萜类化合物，其中含量较多的有α蒎烯、β蒎烯、伞花烃、芳樟醇、水芹烯、对聚伞花烯、松油烯4醇、柠檬烯、孟二烯等。连翘中还含有三萜、环烯醚萜类化合物。其中三萜类成分有齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸、2α羟基白桦脂酸、2α，23 羟基熊果酸 、3β乙酰基20, 25环氧达玛烷24α醇、3β乙酰基20,25环氧达玛烷24β醇、β香树脂醇乙酸酯、20s达玛烷24烯3β，20二醇3乙酸酯、20s，24s环氧达玛烷25醇3α羟基乙酸酯等，环烯醚萜苷类。(5)生物碱类：包括suspensine A、7Omethylegenine、egenine、bicuculline等异喹啉类生物碱。(6)有机酸及甾醇类：从连翘果实中分离出硬脂酸、棕榈酸、丁二酸、香荚兰酸、棕搁酸、琥珀酸、咖啡酸、对羟基苯乙酸甲酯、咖啡酸甲酯、原儿茶酸等有机酸类和β谷甾醇、胡萝卜苷等甾醇类化合物[7]。
1.2 研究目的和意义
连翘具有丰富的化学成分，近年来随着连翘中化合物的药理作用被发现，进一步对连翘的化学成分和分析方法进行研究,找到活性更好的成分、建立快速的控制连翘质量的方法意义重大。因此结合生物活性、药理学等研究，对连翘植物进行深入系统的化学成分分离，为寻找新药做出贡献。本文采用LCMS方法来进行连翘中15种化合物的分离与鉴定。
连翘中化合物的药理作用，(1)抗菌、抗病毒作用：连翘具有广谱抗菌作用，对多种革兰阳性菌、阴性菌均有抑制作用。其煎剂的最低抑菌浓度(MIC) 分别为：肺炎双球菌3.75 mg/mL1、金黄色葡萄球菌3 mg/ mL1、白喉杆菌7.5 mg/mL1。连翘种子挥发油在体外对多种细菌均有较强的抗菌作用，其中以对金黄色葡萄球菌的作用最强，且作用稳定而持久。连翘有效成分连翘酯苷具有极强的抗菌、抗病毒活性，其对金黄色葡萄球菌的抑制作用比四环素还强，是迄今为止连翘属植物中发现的抗菌活性最强的成分之一，为中药连翘的主要特征性成分。连翘酚对金黄色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌也有一定的抑菌作用。连翘还可直接破坏内毒素结构。(2)抗炎作用：连翘的甲醇提取物有明显的抗炎活性，其中的牛蒡苷元是主要的活性中介物质，有显著的抗炎和止痛作用，在急性炎症动物实验模型中，可以抑制毛细管通透性的增加、补充发炎组织中的白血球。连翘醇提物腹腔注射有非常明显的抗渗出作用及降低炎性部位血管壁脆性作用，对炎性屏障的形成无抑制作用，P32标记红细胞实验表明连翘能促进炎性屏障的形成。用人工方法给大白鼠复制无菌性肉芽囊模型，腹腔注射连翘液有抗渗出作用，未见抗增生作用。注射连翘液的大白鼠，其血中P32标记红细胞渗入“炎性肉芽囊”内的红细胞数量明显地减少，表明该连翘有降低炎症病灶区微血管壁脆[8]。(3)抗氧化作用：连翘果实和连翘叶的乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取部分均有较强的抗氧化活性。给予连翘提取物的老鼠，15天后与阴性对照组相比血浆中的肿瘤坏死因子α、白介素β和白介素6都有明显降低。连翘花提取物通过清除活性氧自由基和提高抗氧化酶活力保护线粒体。此外，异连翘酯苷、连翘酯苷A和连翘苷对DPPH 自由基均有一定的清除作用，前2种物质的抗氧化能力大大优于连翘苷，是新的天然抗氧化剂。连翘苷和8羟基松脂素对过氧硝基引起的细胞损害有抵抗作用[9]。(4)保肝作用：连翘煎剂能明显降低大鼠皮下注射四氯化碳引起的血清谷丙转氨酶及碱性磷酸
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