h2o2在介导sa诱导丹参叶片合成丹酚酸b中的信号作用(附件)
摘 要过氧化氢（Hydrogen peroxide，H2O2）作为一种植物体内的气体信号分子近年来得到广泛研究，其在介导外界因子诱导植物次生代谢产物的合成过程中起着重要的作用。本文对H2O2作为一种信号分子在水杨酸（SA）诱导丹参叶片产生丹酚酸（SalB）合成过程中的作用进行了探讨。结果表明：水杨酸可以有效地诱导丹参叶片中H2O2的产生及SalB合成积累，外源施加10~30 mmol/LH2O2也可以有效促进SalB合成积累量的增加，用H2O2的清除剂CAT处理发现，CAT对SA或外源H2O2诱导的SalB合成积累具有消除作用，说明H2O2可能作为SA诱导SalB积累过程中的上游信号分子起作用；用H2O2淬灭剂DMTU处理，可以有效抑制SA对SalB合成的促进作用；用质膜烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide vadenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶（H2O2来源的主要酶）抑制剂IMD处理，可以抑制SalB的合成，但这种抑制效果可以部分被外源施加的SA削弱，说明通过HADPH化酶产生的H2O2受阻时，SA诱导的SalB合成积累也会受到抑制。以上结果表明，H2O2是介导SA诱导丹参叶片中SalB合成积累的信号分子。目 录
1 绪论
1.1 丹参酚酸类化合物的研究 1
1.1.1 丹参酚酸类化合物 1
1.1.2 丹酚酸B的生物合成及生理功能 1
1.2 诱导子对植物次生代谢产物合成的调节 2
1.2.1 诱导子对丹参酚酸类次生代谢产物合成的调节 3
1.2.2 水杨酸对植物细胞中次生代谢物的调节 5
1.3 H2O2对植物次生代谢产物合成的作用 6
1.3.1 植物体内过氧化氢的产生途径和代谢 6
1.3.2 H2O2在植物体内的的信号转导机制 8
1.3.3 H2O2在植物次生代谢产物合成过程中的信号转导作用 9
2 材料与方法
2.1材料、试剂与设备 10
2.1.1 材料来源 10
2.1.2主要试剂 10
2.1.3主要设备 10
2.2 诱导及处理方法 10
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br /> 1.3.2 H2O2在植物体内的的信号转导机制 8
1.3.3 H2O2在植物次生代谢产物合成过程中的信号转导作用 9
2 材料与方法
2.1材料、试剂与设备 10
2.1.1 材料来源 10
2.1.2主要试剂 10
2.1.3主要设备 10
2.2 诱导及处理方法 10
2.3 过氧化氢H2O2含量检测 10
2.4 SalB 提取及含量检测 10
3 结果与分析
3.1水杨酸诱发丹参叶片H2O2释放及SalB合成 12
3.2 H2O2对SalB含量的影响 13
3.3 SalB合成对H2O2具有依赖性 13
3.3.1 CAT在SA及外源施加H2O2诱导丹参叶片中H2O2产生及SalB积累过程中的作用 13
3.3.2 DMTU在外源施加SA及H2O2诱导丹参叶片中H2O2产生及SalB积累过程中的作用 14
3.3.3 IMD 在外源施加SA及H2O2诱导丹参叶片中H2O2产生及SalB累积过程中的作用 16
结论 18
参考文献 20
致谢 22
1 绪论
1.1 丹参酚酸类化合物的研究
1.1.1 丹参酚酸类化合物
丹参又名紫丹参、赤参，《神农本草经》、《本草经疏》、《本草纲目》中均有记载，是历代常用中药。传统中医理论认为，丹参苦、微寒、入心、心包及肝经，具有活血通络、祛瘀止痛、凉血消痛、清心除烦等功效，有“一味丹参，功同四物”之说[1,2]。目前共从丹参中分离得到40余种化合物[3]，丹参水溶性酚酸类成分具有很强的清除自由基和抗氧化作用，其中丹酚酸A和丹酚酸B活性最强，并表现出以较强抗氧化作用为特点的多方面药理作用，临床上广泛用于治疗心血管疾病[4]。
1.1.2 丹酚酸B的生物合成及生理功能
多数丹参水溶性酚酸类成分具有多聚酚酸性的特殊结构，丹参素（图1.1）被认为是各种丹参酚酸类化合物的基本化学结构。大多数多聚酚酸类化合物都可以认为是咖啡酸（图1.1）的衍生物。迷迭香酸从结构上看是咖啡酸与丹参素的二聚物（图1.1）；丹酚酸A（图1.1）是一分子丹参素与两分子的咖啡酸聚合物；丹参酚酸B（图1.1）为四聚物，结构上又是迷迭香酸的二聚体；丹酚酸C则是二分子的丹参素缩合而成的，其它丹酚酸类化合物也有相似的结构。还有丹酚酸L和丹酚酸K等多聚酚酸结构[5]。
丹参主要包含脂溶性二萜类化合物和水溶性酚酸类两大类化合物。脂溶性化合物根据其化学结构可分为邻、对醌型以及其它二萜类化合物，主要包含有：丹参酮（Ⅰ、ⅡA、ⅡB）、隐丹参酮、异丹参酮（Ⅰ、Ⅱ）、异隐丹参酮以及新隐丹参酮等。水溶性酚酸类化合物主要包含有丹酚酸（包含丹酚酸A、B、C、D、E、F和G等）、迷迭香酸、原儿茶醛等。这类水溶性酚酸类化合物的化学结构主要是由R（+）β（3,4二羟基苯基）乳酸和咖啡酸二者聚合或由咖啡酸二聚体聚合而生成的（化学结构见图1.1）。丹酚酸A和丹酚酸B的抗氧化活性远远强于原儿茶醛和丹参素。丹酚酸B是丹参中水溶性酚酸类化合物的指标性成分，而迷迭香酸的合成研究揭示了丹参的药理作用主要表现在对心脑血管系统的作用、对血液系统的作用、对消化系统的作用、对呼吸系统的作用、抗炎、抗菌作用和抗肿瘤作用等[6,7,8]。此外，丹参也具有抗氧化作用、对膜功能的影响、镇痛作用、抗衰老作用等[9,10]。主要有以下几点：（1）对心肌缺血再灌注损伤的保护作用；（2）对心脏微血管内皮细胞缺氧/复氧损伤中的保护作用；（3）动脉粥样硬化防治作用；（4）对心脏功能的影响；（5）对脑的保护作用；（6）对脑缺血损伤的保护作用；（7）对学习记忆功能的影响；（8）抗肝.肾纤维化的作用；（9）抵抗肝的纤维化；(10)抗肾纤维化；(11)抗肿瘤及其他作用。此外，丹酚酸E还可用于白内障的防治，抑制血小板功能、抗衰老、抑制细胞凋亡、增强成骨作用，预防治疗肾炎、肾衰竭、脉管炎、静脉栓塞等疾病。综上所述，有悠久历史的中国传统中药丹参是中医药学中的珍品，拥有广泛的生物活性，其中丹酚酸E是丹参的有效水溶性成分，具有广泛的药理作用。随着基础研究的进一步深入，临床研究的全面展开，相信一定会有更多更广阔的研究成果，丹参必将具有更深的应用前景。
图1.1 酚酸类化合物的碳骨架
丹酚酸结构式中:R=R1=R2=Y=H; Ⅰ:丹酚酸A; Ⅱ:丹酚酸B; Ⅲ:丹酚酸C; Ⅳ:丹酚酸E; Ⅴ:异丹酚酸C; Ⅵ:丹酚酸H; Ⅶ:丹酚酸I; Ⅷ:丹酚酸J
1.2 诱导子对植物次生代谢产物合成的调节
1.2.1 诱导子对丹参酚酸类次生代谢产物合成的调节
酚酸类成分具有重要经济和药用价值，利用诱导子诱导植物提高自身酚酸类成分的产量，目前得到较为广阔的研究。植物受到胁迫促使体内酚酸类成分提高，因为这样的理论事实，酚类物质本身就有抗病性，而且其氧化醌类杀菌力更强，氧化胞外连丝而导致成病原菌扩展受到阻碍，从而导致植株过敏抗性反应；同时酚类物质也形成木质素的前体，使寄主细胞木质化而产生抗病的作用。所以当植物受到外界胁迫后，植物为了能够适应这一环境，体内就会积累酚类物质，如果酚类物质积累越多，那么抗胁迫能力就会越强[11]。
植物在受到外界因子如微生物或化学、物理因素刺激时，自身会发生一系列的防御反应，如氧迸发、与植物致病有关蛋白的表达、细胞壁增厚以及各类植物抗毒素的
1 绪论
1.1 丹参酚酸类化合物的研究 1
1.1.1 丹参酚酸类化合物 1
1.1.2 丹酚酸B的生物合成及生理功能 1
1.2 诱导子对植物次生代谢产物合成的调节 2
1.2.1 诱导子对丹参酚酸类次生代谢产物合成的调节 3
1.2.2 水杨酸对植物细胞中次生代谢物的调节 5
1.3 H2O2对植物次生代谢产物合成的作用 6
1.3.1 植物体内过氧化氢的产生途径和代谢 6
1.3.2 H2O2在植物体内的的信号转导机制 8
1.3.3 H2O2在植物次生代谢产物合成过程中的信号转导作用 9
2 材料与方法
2.1材料、试剂与设备 10
2.1.1 材料来源 10
2.1.2主要试剂 10
2.1.3主要设备 10
2.2 诱导及处理方法 10
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br /> 1.3.2 H2O2在植物体内的的信号转导机制 8
1.3.3 H2O2在植物次生代谢产物合成过程中的信号转导作用 9
2 材料与方法
2.1材料、试剂与设备 10
2.1.1 材料来源 10
2.1.2主要试剂 10
2.1.3主要设备 10
2.2 诱导及处理方法 10
2.3 过氧化氢H2O2含量检测 10
2.4 SalB 提取及含量检测 10
3 结果与分析
3.1水杨酸诱发丹参叶片H2O2释放及SalB合成 12
3.2 H2O2对SalB含量的影响 13
3.3 SalB合成对H2O2具有依赖性 13
3.3.1 CAT在SA及外源施加H2O2诱导丹参叶片中H2O2产生及SalB积累过程中的作用 13
3.3.2 DMTU在外源施加SA及H2O2诱导丹参叶片中H2O2产生及SalB积累过程中的作用 14
3.3.3 IMD 在外源施加SA及H2O2诱导丹参叶片中H2O2产生及SalB累积过程中的作用 16
结论 18
参考文献 20
致谢 22
1 绪论
1.1 丹参酚酸类化合物的研究
1.1.1 丹参酚酸类化合物
丹参又名紫丹参、赤参，《神农本草经》、《本草经疏》、《本草纲目》中均有记载，是历代常用中药。传统中医理论认为，丹参苦、微寒、入心、心包及肝经，具有活血通络、祛瘀止痛、凉血消痛、清心除烦等功效，有“一味丹参，功同四物”之说[1,2]。目前共从丹参中分离得到40余种化合物[3]，丹参水溶性酚酸类成分具有很强的清除自由基和抗氧化作用，其中丹酚酸A和丹酚酸B活性最强，并表现出以较强抗氧化作用为特点的多方面药理作用，临床上广泛用于治疗心血管疾病[4]。
1.1.2 丹酚酸B的生物合成及生理功能
多数丹参水溶性酚酸类成分具有多聚酚酸性的特殊结构，丹参素（图1.1）被认为是各种丹参酚酸类化合物的基本化学结构。大多数多聚酚酸类化合物都可以认为是咖啡酸（图1.1）的衍生物。迷迭香酸从结构上看是咖啡酸与丹参素的二聚物（图1.1）；丹酚酸A（图1.1）是一分子丹参素与两分子的咖啡酸聚合物；丹参酚酸B（图1.1）为四聚物，结构上又是迷迭香酸的二聚体；丹酚酸C则是二分子的丹参素缩合而成的，其它丹酚酸类化合物也有相似的结构。还有丹酚酸L和丹酚酸K等多聚酚酸结构[5]。
丹参主要包含脂溶性二萜类化合物和水溶性酚酸类两大类化合物。脂溶性化合物根据其化学结构可分为邻、对醌型以及其它二萜类化合物，主要包含有：丹参酮（Ⅰ、ⅡA、ⅡB）、隐丹参酮、异丹参酮（Ⅰ、Ⅱ）、异隐丹参酮以及新隐丹参酮等。水溶性酚酸类化合物主要包含有丹酚酸（包含丹酚酸A、B、C、D、E、F和G等）、迷迭香酸、原儿茶醛等。这类水溶性酚酸类化合物的化学结构主要是由R（+）β（3,4二羟基苯基）乳酸和咖啡酸二者聚合或由咖啡酸二聚体聚合而生成的（化学结构见图1.1）。丹酚酸A和丹酚酸B的抗氧化活性远远强于原儿茶醛和丹参素。丹酚酸B是丹参中水溶性酚酸类化合物的指标性成分，而迷迭香酸的合成研究揭示了丹参的药理作用主要表现在对心脑血管系统的作用、对血液系统的作用、对消化系统的作用、对呼吸系统的作用、抗炎、抗菌作用和抗肿瘤作用等[6,7,8]。此外，丹参也具有抗氧化作用、对膜功能的影响、镇痛作用、抗衰老作用等[9,10]。主要有以下几点：（1）对心肌缺血再灌注损伤的保护作用；（2）对心脏微血管内皮细胞缺氧/复氧损伤中的保护作用；（3）动脉粥样硬化防治作用；（4）对心脏功能的影响；（5）对脑的保护作用；（6）对脑缺血损伤的保护作用；（7）对学习记忆功能的影响；（8）抗肝.肾纤维化的作用；（9）抵抗肝的纤维化；(10)抗肾纤维化；(11)抗肿瘤及其他作用。此外，丹酚酸E还可用于白内障的防治，抑制血小板功能、抗衰老、抑制细胞凋亡、增强成骨作用，预防治疗肾炎、肾衰竭、脉管炎、静脉栓塞等疾病。综上所述，有悠久历史的中国传统中药丹参是中医药学中的珍品，拥有广泛的生物活性，其中丹酚酸E是丹参的有效水溶性成分，具有广泛的药理作用。随着基础研究的进一步深入，临床研究的全面展开，相信一定会有更多更广阔的研究成果，丹参必将具有更深的应用前景。
图1.1 酚酸类化合物的碳骨架
丹酚酸结构式中:R=R1=R2=Y=H; Ⅰ:丹酚酸A; Ⅱ:丹酚酸B; Ⅲ:丹酚酸C; Ⅳ:丹酚酸E; Ⅴ:异丹酚酸C; Ⅵ:丹酚酸H; Ⅶ:丹酚酸I; Ⅷ:丹酚酸J
1.2 诱导子对植物次生代谢产物合成的调节
1.2.1 诱导子对丹参酚酸类次生代谢产物合成的调节
酚酸类成分具有重要经济和药用价值，利用诱导子诱导植物提高自身酚酸类成分的产量，目前得到较为广阔的研究。植物受到胁迫促使体内酚酸类成分提高，因为这样的理论事实，酚类物质本身就有抗病性，而且其氧化醌类杀菌力更强，氧化胞外连丝而导致成病原菌扩展受到阻碍，从而导致植株过敏抗性反应；同时酚类物质也形成木质素的前体，使寄主细胞木质化而产生抗病的作用。所以当植物受到外界胁迫后，植物为了能够适应这一环境，体内就会积累酚类物质，如果酚类物质积累越多，那么抗胁迫能力就会越强[11]。
植物在受到外界因子如微生物或化学、物理因素刺激时，自身会发生一系列的防御反应，如氧迸发、与植物致病有关蛋白的表达、细胞壁增厚以及各类植物抗毒素的
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