桦菌芝黄酮类成分的纯化工艺研究(附件)
本人签名 日期 摘 要桦菌芝Pyropolyporus fomentarius（L.ex.Fr.）Teng.为多孔菌科植物木蹄的菌体，多寄生于桦树及栎树的树干上，味淡微苦、性平，能消积、化瘀、抗癌。用于治疗小儿食积、食管癌、胃癌、子宫癌。桦菌芝在陕西省乃至全国都有比较高的蕴藏量，具有较高的开发利用价值。桦菌芝乙醇提取液经理化鉴别，表明桦菌芝中含有黄酮，且可能为二氢黄酮。本次课题以桦菌芝为原料、以桦菌芝黄酮类成分含量为指标,考察大孔树脂型号、吸附流速、径高比、水洗除杂体积、洗脱剂浓度、洗脱剂体积和上样浓度对纯化结果的影响，建立大孔树脂纯化桦菌芝黄酮类成分的最佳参数纯化工艺。实验结果表明，D-101号大孔树脂对桦菌芝黄酮的吸附性能好于其他型号树脂，其最佳纯化工艺参数为: 上样浓度保持在3.944～3.380mg/ml, 温度为20～30℃, PH 5.5～6.5,3倍柱体积水洗后，5倍柱体积60%乙醇洗脱。在次工艺条件下，桦菌芝黄酮纯度30.1%，可达收率为55.7%。本实验可以用较低的成本得到含量较高的桦菌芝黄酮类化合物，为桦菌芝资源的开发利用特别是新制剂或新药的研发奠定基础。本课题的开展及后期成果的取得，对于进一步合理利用、开发桦菌芝资源具有重要的意义，对于地方经济的发展也具有一定的促进作用。
Key words: Pyropolyporus fomentarius;Macroporous resin ;Flavone;Purification process 目 录
1 绪论 1
1.1 研究的背景和意义 1
1.1.1 研究的背景 1
1.1.2 研究的意义 1
1.2 桦菌芝的概述 2
1.2.1 植物形态及分布 2
1.2.2 性味归经及功能主治 2
1.2.3 化学成分 2
1.2.4 药理作用研究 3
1.2.5 临床应用 4
1.3 黄酮类化合物常用纯化方法简介 4
1.3.1 经典纯化方法简介 4
1.3.2 现代纯化方法介绍 5
2 实验部分 7
2.1 试药与 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
仪器 7
2.1.1 材料预处理 7
2.1.2 材料与试剂 7
2.1.3 主要仪器 7
2.2 实验方法 7
2.2.1 桦菌芝黄酮含量测定方法的建立 7
2.2.2 桦菌芝黄酮鉴别 10
2.2.3 桦菌芝黄酮纯化工艺考察 11
结论 19
参考文献 21
致谢 23
1 绪论
1.1 研究的背景和意义
1.1.1 研究的背景
黄酮类化合物（flavonoids）是一类存在于自然界的、具有2苯基色原酮（flavone）结构的化合物。它们在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方面起着重要的作用[1]。黄酮类化合物属于植物次级代谢产物，具有多种生物活性,有文献记载，约有20%的中草药中含有黄酮类化合物。近年来，科学家们发现其具有抗氧化、降低脂质过氧化反应、预防心血管疾病及抗衰老等作用。随着对其研究方法和技术的不断提高，又发现了许多新的种类和生理作用。特别是抗自由基和抗癌、防癌的作用，使黄酮类化合物的研究进入了一个新的阶段[2]。但研究表明，在众多黄酮类化合物中，因其结构不同，有的表现出生物活性，有的却没有生物活性，而且生物活性亦因其结构的差异而不同，所以提取分离出具有较高生物活性的黄酮类化合物对医药及食品工业是十分重要的[3]。
桦菌芝Pyropolyporus fomentarius（L.ex.Fr.）Teng.为多孔菌科植物木蹄的菌体，其性平，味微苦，水煎服，治小儿积食，药用有很好的消积化癖作用。民间用于治疗胃癌、子宫癌、道癌等病[4]。桦菌芝在陕西省乃至全国都有比较高的蕴藏量。多数资料表明，多孔菌中所含的黄酮类化合物具有抗癌功效。但目前对桦菌芝的研究主要集中在多糖抗癌作用及其机制方面，对于桦菌芝化学成分的提取分离纯化研究、其他类成分的活性研究以及质量标准研究的报道较少,限制了对其资源的开发利用，不利于高附加值产品的研制。
1.1.2 研究的意义
本次课题以桦菌芝为原料、以桦菌芝总黄酮类得率为指标,考察大孔吸附树脂型号、吸附流速、径高比、除杂体积、洗脱剂浓度、洗脱剂体积和上样浓度对纯化结果的影响，建立大孔树脂纯化桦菌芝黄酮类成分的最佳参数纯化工艺。本实验可以用较低的成本得到含量较高的桦菌芝黄酮类化合物，为桦菌芝资源的开发利用特别是新制剂或新药的研发奠定基础。本课题的开展及后期成果的取得，对于进一步合理利用、开发桦菌芝资源具有重要的意义，对于地方经济的发展也具有一定的促进作用。
1.2 桦菌芝的概述
1.2.1 植物形态及分布
桦菌芝(Phropolyporus fomentarius)，又名木蹄、木蹄层孔菌、小驴蹄子，多寄生于桦树及栎树的树干上，在杨、柳、赤杨、椴、榆、梨、苹果及李等阔叶树的树干上也长[5]。为真菌多孔菌科褐层孔属植物木蹄的菌体。菌盖马蹄形，灰色，浅褐色至黑色，有厚角质皮壳和环状层纹，菌肉木栓质，锈色；菌管多层，层次不甚明显，每层厚35mm，颜色较菌肉浅；管口圆形，灰色至浅褐色，每毫米34个；孢子长椭圆形，无色[67]。分布黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西、河南、陕西（秦巴山区）、甘肃、新疆、四川、贵州、云南、广西等地。尤其是东北三省的产量最高[8]。
图1.1 桦菌芝药材
1.2.2 性味归经及功能主治
性平，味苦、淡，归脾、胃、肾经，具有消积、抗癌之功效[9]。可用于治疗小儿食积、胃癌、子宫癌、道癌等病[10]。
1.2.3 化学成分
桦菌芝化学成分主要包括萜类、苷类、氨基酸、氨基酸类，以及蛋白质、核苷酸有机酸、糖、脂类、色素类等。陆勇芹[11]等人对木蹄层孔菌做了简单的化学成分系统预试，在水提取液、酸性乙醇提取液、甲醇提取液和乙醚提取液中主要检测到酚性成分、有机酸、糖、多糖和苷类、内酯、香豆素及其苷类、萜类化合物、植物甾醇及其苷类，并通过检测推断可能含有鞣质、黄酮类及其苷类。文献记载[12]采用东北的桦菌芝粉末用工业乙醇萃取，提取物用乙酸乙酯溶解，经浓缩得到浸膏使吸附于硅胶上（80100目），依次用石油醚、乙酸乙酯、甲醇洗脱得三部分，采用低压硅胶柱层析，光谱数据分析等方法，确定桦菌芝中含有麦角甾7、222烯3酮、辅酶Q、乙酰齐墩果酸、麦角甾醇、224烯3酮。Kapich,A.N.[13]等人在木蹄层孔菌的菌丝中检测到8种磷脂成分：磷酸卵磷酯、脑磷酯、磷脂酰甘油、丝氨酸磷脂、磷脂酰肌醇、心肌磷脂、溶血磷脂胆碱、鞘磷脂。张艳华[14]用植物化学系统预试法显示桦菌芝PFEAF提取物中含有皂昔类固醇、黄酮类和酚类。检测中没有发现生物碱的存在。
1.2.4 药理作用研究
1.2.4.1 抗肿瘤作用
刘量[15]等人研究木蹄层孔菌子实体乙醇提取物，并发现EEF对肿瘤生长有明显抑制、对荷瘤鼠生存天数可以延长。陆勇芹[16]等人采用MTT法研究木蹄层孔菌子实体不同溶剂提取物的抗肿瘤活性，并得出木蹄层孔菌子实体的抗肿瘤活性是氯仿和乙酸乙酯提取物。张艳华[17]从桦菌芝乙醇提取乙酸乙酯成分及桦菌芝乙醇提取物氯仿组分抑制肿瘤细胞生长极其机制研究，来研究桦菌芝PFEAF抑制K562增殖的机制，结果表明，桦菌芝乙醇提取物乙酸乙酷组分提取物和乙醇提取物氯仿组分都能够抑制肿瘤细胞K562的增殖，更重要的是，桦菌芝PFEAF提取物对K562细胞的细胞毒作用是选择性的，对正常细胞没有抑制增殖能力。桦菌芝乙醇提取物石油醚组分能抑制荷瘤小鼠上S180肉瘤的生长，同时，对免疫器官没有大的毒性伤害。
Key words: Pyropolyporus fomentarius;Macroporous resin ;Flavone;Purification process 目 录
1 绪论 1
1.1 研究的背景和意义 1
1.1.1 研究的背景 1
1.1.2 研究的意义 1
1.2 桦菌芝的概述 2
1.2.1 植物形态及分布 2
1.2.2 性味归经及功能主治 2
1.2.3 化学成分 2
1.2.4 药理作用研究 3
1.2.5 临床应用 4
1.3 黄酮类化合物常用纯化方法简介 4
1.3.1 经典纯化方法简介 4
1.3.2 现代纯化方法介绍 5
2 实验部分 7
2.1 试药与 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
仪器 7
2.1.1 材料预处理 7
2.1.2 材料与试剂 7
2.1.3 主要仪器 7
2.2 实验方法 7
2.2.1 桦菌芝黄酮含量测定方法的建立 7
2.2.2 桦菌芝黄酮鉴别 10
2.2.3 桦菌芝黄酮纯化工艺考察 11
结论 19
参考文献 21
致谢 23
1 绪论
1.1 研究的背景和意义
1.1.1 研究的背景
黄酮类化合物（flavonoids）是一类存在于自然界的、具有2苯基色原酮（flavone）结构的化合物。它们在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方面起着重要的作用[1]。黄酮类化合物属于植物次级代谢产物，具有多种生物活性,有文献记载，约有20%的中草药中含有黄酮类化合物。近年来，科学家们发现其具有抗氧化、降低脂质过氧化反应、预防心血管疾病及抗衰老等作用。随着对其研究方法和技术的不断提高，又发现了许多新的种类和生理作用。特别是抗自由基和抗癌、防癌的作用，使黄酮类化合物的研究进入了一个新的阶段[2]。但研究表明，在众多黄酮类化合物中，因其结构不同，有的表现出生物活性，有的却没有生物活性，而且生物活性亦因其结构的差异而不同，所以提取分离出具有较高生物活性的黄酮类化合物对医药及食品工业是十分重要的[3]。
桦菌芝Pyropolyporus fomentarius（L.ex.Fr.）Teng.为多孔菌科植物木蹄的菌体，其性平，味微苦，水煎服，治小儿积食，药用有很好的消积化癖作用。民间用于治疗胃癌、子宫癌、道癌等病[4]。桦菌芝在陕西省乃至全国都有比较高的蕴藏量。多数资料表明，多孔菌中所含的黄酮类化合物具有抗癌功效。但目前对桦菌芝的研究主要集中在多糖抗癌作用及其机制方面，对于桦菌芝化学成分的提取分离纯化研究、其他类成分的活性研究以及质量标准研究的报道较少,限制了对其资源的开发利用，不利于高附加值产品的研制。
1.1.2 研究的意义
本次课题以桦菌芝为原料、以桦菌芝总黄酮类得率为指标,考察大孔吸附树脂型号、吸附流速、径高比、除杂体积、洗脱剂浓度、洗脱剂体积和上样浓度对纯化结果的影响，建立大孔树脂纯化桦菌芝黄酮类成分的最佳参数纯化工艺。本实验可以用较低的成本得到含量较高的桦菌芝黄酮类化合物，为桦菌芝资源的开发利用特别是新制剂或新药的研发奠定基础。本课题的开展及后期成果的取得，对于进一步合理利用、开发桦菌芝资源具有重要的意义，对于地方经济的发展也具有一定的促进作用。
1.2 桦菌芝的概述
1.2.1 植物形态及分布
桦菌芝(Phropolyporus fomentarius)，又名木蹄、木蹄层孔菌、小驴蹄子，多寄生于桦树及栎树的树干上，在杨、柳、赤杨、椴、榆、梨、苹果及李等阔叶树的树干上也长[5]。为真菌多孔菌科褐层孔属植物木蹄的菌体。菌盖马蹄形，灰色，浅褐色至黑色，有厚角质皮壳和环状层纹，菌肉木栓质，锈色；菌管多层，层次不甚明显，每层厚35mm，颜色较菌肉浅；管口圆形，灰色至浅褐色，每毫米34个；孢子长椭圆形，无色[67]。分布黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西、河南、陕西（秦巴山区）、甘肃、新疆、四川、贵州、云南、广西等地。尤其是东北三省的产量最高[8]。
图1.1 桦菌芝药材
1.2.2 性味归经及功能主治
性平，味苦、淡，归脾、胃、肾经，具有消积、抗癌之功效[9]。可用于治疗小儿食积、胃癌、子宫癌、道癌等病[10]。
1.2.3 化学成分
桦菌芝化学成分主要包括萜类、苷类、氨基酸、氨基酸类，以及蛋白质、核苷酸有机酸、糖、脂类、色素类等。陆勇芹[11]等人对木蹄层孔菌做了简单的化学成分系统预试，在水提取液、酸性乙醇提取液、甲醇提取液和乙醚提取液中主要检测到酚性成分、有机酸、糖、多糖和苷类、内酯、香豆素及其苷类、萜类化合物、植物甾醇及其苷类，并通过检测推断可能含有鞣质、黄酮类及其苷类。文献记载[12]采用东北的桦菌芝粉末用工业乙醇萃取，提取物用乙酸乙酯溶解，经浓缩得到浸膏使吸附于硅胶上（80100目），依次用石油醚、乙酸乙酯、甲醇洗脱得三部分，采用低压硅胶柱层析，光谱数据分析等方法，确定桦菌芝中含有麦角甾7、222烯3酮、辅酶Q、乙酰齐墩果酸、麦角甾醇、224烯3酮。Kapich,A.N.[13]等人在木蹄层孔菌的菌丝中检测到8种磷脂成分：磷酸卵磷酯、脑磷酯、磷脂酰甘油、丝氨酸磷脂、磷脂酰肌醇、心肌磷脂、溶血磷脂胆碱、鞘磷脂。张艳华[14]用植物化学系统预试法显示桦菌芝PFEAF提取物中含有皂昔类固醇、黄酮类和酚类。检测中没有发现生物碱的存在。
1.2.4 药理作用研究
1.2.4.1 抗肿瘤作用
刘量[15]等人研究木蹄层孔菌子实体乙醇提取物，并发现EEF对肿瘤生长有明显抑制、对荷瘤鼠生存天数可以延长。陆勇芹[16]等人采用MTT法研究木蹄层孔菌子实体不同溶剂提取物的抗肿瘤活性，并得出木蹄层孔菌子实体的抗肿瘤活性是氯仿和乙酸乙酯提取物。张艳华[17]从桦菌芝乙醇提取乙酸乙酯成分及桦菌芝乙醇提取物氯仿组分抑制肿瘤细胞生长极其机制研究，来研究桦菌芝PFEAF抑制K562增殖的机制，结果表明，桦菌芝乙醇提取物乙酸乙酷组分提取物和乙醇提取物氯仿组分都能够抑制肿瘤细胞K562的增殖，更重要的是，桦菌芝PFEAF提取物对K562细胞的细胞毒作用是选择性的，对正常细胞没有抑制增殖能力。桦菌芝乙醇提取物石油醚组分能抑制荷瘤小鼠上S180肉瘤的生长，同时，对免疫器官没有大的毒性伤害。
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